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人体基因组中，蛋白质编码基因仅占不到2%的比例，剩余的大部分是非编码区域。其中，非编码调控元件（NCREs）发挥着至关重要的作用，它们在特定的时间和地点指挥着基因的转录，从而影响着细胞的生长、发育和功能。在已知功能基础上，将NCREs分为不同的片段，如非编码RNA、启动子、增强子、沉默子等。
然而，由于NCREs的长度、功能和位置各不相同，传统的实验方法（如表1）难以全面研究非编码基因的功能机制。近日，一项发表在Nature Biomedical Engineering杂志上的研究，开发了一种全新的双CRISPR筛选系统，可以系统地研究基因组中数千个 NCREs的功能，并取得了突破性进展。
表1.非编码基因研究方法
双CRISPR筛选系统的原理
双CRISPR筛选系统基于CRISPR-Cas9文库筛选技术（图1），利用CRISPR-Cas9技术精确地靶向，并删除NCREs。研究人员通过设计成对sgRNA的文库，靶向NCREs的两端，并通过CRISPR-Cas9技术将NCREs从基因组中删除。进一步通过观察细胞生长和药物响应的变化，可以确定对细胞功能至关重要的NCREs。
图1. CRISPR-Cas9文库筛选流程
双CRISPR筛选系统的研究成果
研究人员利用双CRISPR系统研究了人类基因组中的4047个高度保守元件（UCEs）、1527个体内验证的保守增强子，以及K562细胞中13539个预测的增强子（图2），研究取得了多项突破性进展：
图2.K562细胞中必需增强子的鉴定
1. 发现了许多对细胞生存和药物响应至关重要的NCREs，其中一些是在进化过程中高度保守的元件，可能具有基本的生物学功能。
2. 揭示了NCREs的双重功能，NCREs既可以作为增强子，促进基因转录；也可以作为沉默子，抑制基因转录。
3. 发现了NCREs的集群效应，许多NCREs以集群的形式存在，并且可以协同作用，共同调控同一基因或基因簇。
4. 证明了NCREs在药物耐药性中的作用，研究发现，某些NCREs的缺失会导致细胞对药物的耐药性增加。
5. 揭示了UCEs在心脏发育中的关键作用，其中，PAX6-Tarzan的UCEs对人类胚胎干细胞向心肌细胞分化至关重要。
双CRISPR筛选系统的优势
🔹 高通量：可同时研究数千个NCRE的功能。
🔸 精确性：成对的sgRNA可以精确靶向，并删除目标NCRE。
🔹 可重复性：筛选过程可以重复进行，确保结果的可靠性。
🔸 意义与展望：为人类健康事业带来突破。
这项研究为理解NCREs的功能和作用机制提供了重要的线索，也为开发新的药物靶点和治疗策略提供了新的思路。例如，可以利用双CRISPR筛选系统来编辑NCREs，从而治疗与NCREs相关的疾病，例如癌症和心血管疾病。
未来，这项技术还有望应用于：
▪ 研究不同细胞类型中NCREs的功能；
▫ 研究NCREs在不同疾病发生发展中的作用；
▪ 研究NCREs与表观遗传修饰之间的关系；
▫ 研究NCREs在基因组三维结构中的作用。
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