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无缝克隆丨关于Gibson Assembly，你想要了解的都在这里

舒桐科技

2023-12-21

导读：基于Gibson Assembly的无缝克隆是一种适用于任意方法线性化的质粒载体与单个或多个DNA片段组装，以及多位点突变构建的技术。

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Gibson Assembly的由来

2008年，J.Craig Venter研究所的Daniel Gibson博士及其同事在Science上共同发表了关于生殖支原体基因组组装的文章；这篇文章运用到的DNA片段组装技术在2009年发表于Nature Methods。自那时起，该技术经历了改进和扩展，成为合成生物学和分子生物学领域中的一种重要工具，它也以发明者Daniel Gibson博士而命名为“Gibson Assembly”。

Gibson Assembly

基于Gibson Assembly的无缝克隆是一种适用于任意方法线性化的质粒载体与单个或多个DNA片段组装，以及多位点突变构建的技术；具有快速、简便、高效、多片段组装和定向克隆等特点，且不依赖限制性内切酶位点，只需在引物合成时在末端引入与质粒载体末端一致的同源碱基（15~25 bp），这些同源碱基也被称为“同源臂”，PCR扩增获得DNA片段后，DNA片段和线性化载体按一定比例混合，经重组酶在一定温度和时间的催化下即完成定向克隆。

Gibson Assembly的整体实验流程如图所示：

PART/1

载体线性化

采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化：

①酶切法：采用单酶切或双酶切获取线性化载体，酶切后进行回收纯化；

②反向PCR法：在插入位点的两侧设计方向相反的引物扩增载体，胶回收线性化的质粒片段。

PART/2

PCR扩增插入片段

插入片段的扩增引物设计是Gibson Assembly能否成功的关键。可通过基因相关软件和生物公司网站的设计工具来帮助设计引物。如果采用酶切法线性化载体，则需要保留酶切位点，设计好的引物用于插入DNA片段的PCR扩增。

（1）引物设计

在插入片段正反向扩增引物的5’端引入线性化载体两末端同源序列，使扩增后的插入片段5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应一致的同源序列。

插入片段正向扩增引物设计公式为：

5’－上游载体末端同源序列（15~25 bp）＋酶切位点（可保留或删除）＋基因特异性正向扩增引物序列－3’

插入片段反向扩增引物设计公式为：

5’－下游载体末端同源序列（15~25 bp）＋酶切位点（可保留或删除）＋基因特异性反向扩增引物序列－3’

小贴士：

a. 上/下游载体末端同源序列，GC含量40%~60%为宜；基因特异性正/反向扩增引物序列Tm值60~65℃为宜；

b. 根据自身需要保留或删除酶切位点；

c. 计算退火温度时，只计算基因特异性扩增序列的Tm值，引入的同源序列和酶切位点不参与计算；

d. 引物长度超过40 bp时，在引物合成时可以选用PAGE纯化方式，提高阳性克隆率；

e. 插入片段有多个重复序列时，可以根据自身实验需要添加一部分碱基设计引物。

（2）PCR扩增

使用高保真聚合酶扩增，无需考虑产物末端有无A尾（重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现）。

PART/3

同源重组反应

重组反应是Gibson Assembly的核心。其本质是通过三种酶在一定条件下的协同作用从而对线性化载体和插入片段进行组装。

（1）线性化载体与插入片段的使用量计算

在进行重组反应之前，需要计算载体和片段的最适入量，以达到最佳的组装效果。

举例来说，在20 μL重组反应体系中最适克隆载体使用量为0.03 pmol，最适插入片段使用量为0.06 pmol（载体与插入片段摩尔比为1:2）。

这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数] ng（0.03 pmol）

最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数] ng（0.06 pmol）

比如，将长度为2 kb的插入片段克隆至长度为5 kb的克隆载体时，克隆载体的最适使用量应为：0.02 × 5000 = 100 ng；插入片段最适使用量应为：0.04 × 2000 = 80 ng。

小贴士：

a. 当插入片段长度大于克隆载体时，最适克隆载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即将插入片段当做克隆载体，克隆载体当做插入片段进行计算；

b. 20 μL重组体系中线性化克隆载体的使用量应在50~200 ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在10~200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可；

c. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物未进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4 μL。

（以上仅作举例参考，具体操作请按产品说明书进行）

（2）重组反应

重组反应包含了三种不同类型的酶，这三种酶的作用过程大致如下：

• 切割：T5 Exonuclease从DNA片段的5’端切割一条链，产生DNA 3’突出末端（overhang）。之后互补的DNA片段同源末端进行退火配对结合，形成一个有间隙（gap）的环状DNA；

• 填补：Phusion DNA聚合酶通过DNA合成填补间隙，产生一个只有缺刻（nick）的环状DNA；

• 连接：Taq DNA连接酶通过形成磷酸二酯键修复缺刻，得到一个完整的双链DNA，也就是完整的环状质粒。

将目的DNA片段和线性化载体按比例混合并加入相应剂量的重组酶，在50℃条件下孵育15-60 min，即可完成组装。

（以上条件仅作参考，具体实验条件请按产品说明书进行）

PART/4

转化感受态细胞

转化至感受态细胞，涂布划线，并挑出阳性克隆子。感受态细胞的选择建议：

①常规克隆，质粒＜15 kb，推荐使用DH5α Competent E.coli或其他等效感受态；

②大片段克隆，质粒＞10 kb，推荐使用XL10 Competent E.coli或其他等效感受态

Gibson Assembly的优缺点

优点	缺点
位点选择灵活：载体任意位置基因克隆，不受酶切位点限制；	不适用于高度重复的片段重组，重复片段会影响同源臂的设计与连接；
适合多片段重组：传统酶切酶连需要分步进行，耗时较长，Gibson Assembly可实现一步多达6个片段的连接；	无缝克隆组装小片段效果较差，因T5 Exonuclease可降解小片段，Gibson Assembly的片段最好不低于200 bp；
连接速度快：相比T4连接酶（即传统酶切酶连法）的数小时甚至过夜连接，Gibson Assembly仅需1小时完成连接，大大缩短连接时间；	如果片段的末端含有稳定的单链DNA二级结构如发夹结构或茎环结构（可能发生在终止子上），因为抑制了单链退火，阻止了相邻片段的连接，会导致连接效率降低；
不引入额外序列：Gibson Assembly可以实现载体与片段的无缝拼接，不引入额外序列，对目的蛋白表达不产生干扰。	每个片段的长引物（同源臂）必须专门设计，对于每个片段及其相邻片段都是特异性的，所以只能在某一特定的实验中使用。

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