基因编辑之Prime editor的进阶历程

CRISPR：(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)规律成簇的间隔短回文重复序列，能够对目标基因及其转录产物进行定向改造，实现特定DNA片段的加入、删除、特定DNA碱基的缺失、替换等，以改变目的基因或调控原件的序列、表达量或功能。

Cas9是一种常用的核酸酶工具，能够用来修饰多种生物的基因组序列。在sgRNA的引导下，Cas9特异性的切割靶标序列，造成DNA双链的断裂 (Double-strand DNA breaks, DSBs)。由以下两种常规的修复途径进行修复：

1）易错修复，利用非同源末端连接 (NHEJ，Non-homologous end joining) 的修复。

      优点：能快速修复双链断裂

      缺点：会在双链断裂位点产生小的插入缺失。大多数情况下会导致阅读框内的氨基酸插入缺失，或者移码突变引起的目标基因上开放阅读框 (Open reading frame, ORF) 提前终止，在靶基因内形成功能缺失性的突变。

2）精准修复，同源重组修复 (HDR，Homology-directed repair)。

      优点：能够借助外源引入的短单链DNA序列或质粒为模板，介导替换或插入。

      缺点：HDR效率通常也比较低，且受到NHEJ竞争作用的进一步限制

Prime editor——David Liu实验室开发的CRISPR base editor是一项可以引入DNA目标点突变但无需DSB的技术。

PE(Prime eidtor)： 连接一个逆转录酶（Reverse transcriptase,RT)结构域的nCas9和先导编辑引导RNA（pegRNA）组成。

pegRNA：包含single guide RNAs(sgRNAs)，及3’端的一段引物结合序列（prime binding site,PBS）。

PE蛋白：Cas9切口酶（Cas9 nickase 即dead Cas9，仅有切割单链的功能，H840A）与逆转录酶（M-MLV RT）融合而成。

在pegRNA的引导下，nCas9 (H840A)切口酶切断含PAM的靶点DNA链，断裂的靶DNA链与pegRNA的3'末端PBS序列互补并结合，之后通过逆转录酶，沿RT模板序列开始逆转录反应。反应结束后DNA链的切口处会形成处在动态平衡中的5'-和3'-flap结构，其中5'末端会被具有5'核酸内切酶和外切酶活性FEN1蛋白及核酸外切酶活性的EXO1蛋白切除。而3'末端通过反转录酶形成编辑序列，之后经DNA连接和修复后靶位点处便实现了精准的基因编辑。

PE1:  nCas9+M-MLV+pegRNA

验证了PE可以直接安装靶向的断裂、插入和删除，而无需DBS和DNA模板。

缺点：编辑效率受PBS长度影响，最大编辑效率为0.7%-5.5%。编辑效率极低。

PE2: nCas9+M-MLV（D200N+L603W+T330P+ T306K+W313F ）+pegRNA

对M-MLV进行点突变，编辑效率提高了8-10倍。

缺点：PE2编辑后的DNA双链为杂合链，即一条为编辑链，一条为非编辑链，会导致错配率高。

PE3: nCas9+M-MLV（ D200N+L603W+T330P+ T306K+W313F ）+pegRNA+nicking RNA

nicking RNA的引入使编辑效率达55%。

缺点：nicking RNA的引入提高了编辑效率，但同时也增加了非目标插入和缺失的频率。

PEmax系统优化及pegRNA的改造

优化MMLV的密码子，在nCas9与MMLV融合位点间添加长度为34个氨基酸的衔接序列（包含SV40 NLS），在融合蛋白C末端添加C-Myc的NLS序列，以及在nCas9中引入R221K和N394K突变。从而提高编辑效率。

pegRNAs的3`末端易降解，会明显干扰先导编辑的效率。在3`末端添加结构性的RNA基序可增加pegRNAs的稳定性，改造后的epegRNAs可显著提升先导编辑的编辑效率。

PE4:  PE2+MLH1dn

PE5:  PE3+MLH1dn

MMR：DNA错配修复，会阻碍先导编辑，并促进不需要的indel副产物。抑制MMR通路的关键因子，如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2能有效增强PE的编辑效率。

因此作者对MLH1 △754-756(MLH1 dn）和-NLS进行了突变，发现都能与MSH2结合来抑制MMR活性，从而提高PE的编辑效率。

PE-PACE（从PE6a到PE6g）

PACE: 噬菌体辅助进化技术，是刘如谦团队在2011年开发的一种蛋白质定向进化方法，该系统可以对有缺陷的噬菌体基因进行PE编辑，从而对噬菌体进行达尔文选择。在数百小时的时间里，携带原始PE编辑器的噬菌体经历了数千代的进化，迅速产生具有全新结构的逆转录酶。由此产生了一套新的PE编辑器——从PE6a到PE6g，每个系统都包含一个新的逆转录酶或Cas9变体。

PE6a到PE6g具有不同的编辑偏好，可以根据实验需求进行选择。另外通过双AAV载体递送新型PE编辑器，使得以前在体内效率低下的 PE 策略可以使用 PE6 变体来实现。这种巨大的跨越足以支持这些新型PE编辑器在治疗应用中的发展。

珠海舒桐医疗科技有限公司长期致力于基因编辑领域，公司的研发团队潜心研发，开发和掌握了多项碱基编辑及先导编辑技术，能为科研工作者提供可靠的基因编辑服务，欢迎垂询。另外，珠海舒桐医疗是国内首家提供脱靶检测服务的公司，可提供GUIDE-seq体内脱靶检测、AID-seq体内脱靶检测等多种服务。

珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。

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参考文献

1. Anzalone A V， Randolph P B , Davis J R ,et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA[J].Nature, 2019(7785).DOI:10.1038/s41586-019-1711-4.

2. Chen P J , Hussmann J A , Yan J ,et al.Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes[J].Cell, 2021, 184(22).DOI:10.1016/j.cell.2021.09.018.

3.https://www.cell.com/cell/pdf/S0092-8674(23)00854-1.pdf

4.https://www.nature.com/articles/s41587-021-01039-7