Advanced Science|大大扩宽编辑窗口，最长可达43个nt！新型CRISPR-Cas12b平台在微生物中取得重大突破

舒桐科技

2024-04-22

导读：研究背景CRISPR-Cas系统在基因编辑、基因调控等领域具有广泛的应用。目前有多种基于CRISPR的基因编

研究背景

CRISPR-Cas系统在基因编辑、基因调控等领域具有广泛的应用。目前有多种基于CRISPR的基因编辑工具，包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a和CRISPR-Cas12f1等。通过失活的Cas9(dCas9)或Cas12a蛋白与激活或抑制模块融合，可实现基因激活或抑制。并且，基于CRISPR的基因编辑技术还衍生出一种新的基因编辑工具——Base editor，但是目前BE在微生物细胞中应用时，编辑窗口有限(5-6个核苷酸)，无法满足构建多样性变体库的需求，扩展编辑窗口是一个主要挑战。

2024年4月11日，Advanced Science(IF: 16.8)在线发表了江南大学周哲敏，韩来闯团队的最新研究进展：“A New-Generation Base Editor with an Expanded Editing Window for Microbial Cell Evolution In Vivo Based on CRISPR‒Cas12b Engineering“。本研究通过工程化CRISPR-Cas12b，开发了一种基于dCas12b的CRISPRi系统，并且建立了扩展编辑窗口的新型碱基编辑器，在枯草杆菌和大肠杆菌中成功验证了其通用性。该研究极大地扩大BEs的编辑窗口，指数级地增加了变异库的容量，极大地提高了微生物细胞进化的筛选效率。

作者首先构建了两种CRISPR-Cas12b系统(基于AaCas12b和BhCas12b)用于芽胞杆菌基因组编辑，靶向sacA和aprE两个基因位点（Fig1）。结果表明，BhCas12b系统能高效地介导sacA和aprE基因的完全缺失，缺失效率达到100%。但AaCas12b系统在sacA位点的缺失效率很低，仅1/23。因此与AaCas12b系统相比，BhCas12b系统是一种更加强大的芽胞杆菌基因组编辑工具。

Fig1

因此，作者就以BhCas12b进行接下来的研究。通过序列比对和分子对接确定BhCas12b中D574、E828和D952三个残基可能影响核酸酶活性，位于RuvC核酸酶结构域，远离sgRNA结合位点。通过定点突变，将这三个残基同时突变为丙氨酸(D574A/E828A/D952A)，得到失活的dBhCas12b，其无法介导基因敲除，说明成功失活了BhCas12b的核酸酶活性（Fig2）。

Fig2

作者通过抑制eGFP实验，验证dBhCas12b的突变的确影响sgRNA结合和DNA识别能力，进一步实验表明，该CRISPRi系统也能高效抑制B.subtilis内源基因的转录起始（Fig3），证明dBhCas12b的催化失活突变未影响其与sgRNA结合和DNA靶向能力，作者成功构建了基于dBhCas12b的高效CRISPRi基因转录调控系统。

Fig3

在此基础上，作者构建了四种基于dBhCas12b的碱基编辑工具，并评估所构建BEs在B. subtilis和E. coli中的编辑窗口和效率（Fig4）。结果表明，在B. subtilis中，含有两个UGI的CBE-IV表现出最佳编辑效率，编辑窗口扩展至约19个核苷酸；ABE系统在B. subtilis中的编辑窗口为19个核苷酸，比常用的SpCas9和LbCas12a系统宽2倍；在E. coli中，CBE系统展现出惊人的约43个核苷酸的超宽编辑窗口，覆盖整个靶点区域甚至更多。总之，dBhCas12b介导的BE系统大幅扩展了编辑窗口，为细菌细胞进化提供新工具。

Fig4

接下来，作者利用新开发的dBhCas12b-CBE系统筛选出高效的核糖体结合位点(RBS)序列。他们设计了一个极端RBS和间隔序列(RS)片段，包含15个连续的G，用单一sgRNA靶向编辑。通过测量荧光强度，他们从筛选的32个克隆中发现了具有54.38倍和68.1倍更强RBS活性的克隆23和克隆26，序列分析显示这些克隆的RS区域发生了突变，在约17个核苷酸的编辑窗口内产生了保守的RBS序列"GGAGG"（Fig5）。这表明新的CBE能利用单一sgRNA高效靶向极端序列组成，且具有更宽的编辑窗口，比现有的BETTER技术更加强大。

Fig5

研究人员在大肠杆菌中测试了新的dBhCas12b-based CBE系统。他们靶向了rpsE基因，通过突变可以使大肠杆菌BL21株获得抗spectinomycin抗性。结果显示，该CBE系统在大肠杆菌中具有高达99%的转换效率，编辑窗口范围达到C12到C23(36个核苷酸)或C15到C26(42个核苷酸)，远远超出了原始的protospacer区域。这是迄今为止报道的最宽的BE编辑窗口（Fig6）。通过筛选，他们成功获得了多个抗spectinomycin的大肠杆菌BL21突变株，其中一些突变位点如S32、T34、A35等是首次被发现与抗性相关。这些结果证明了新的dBhCas12b-based CBE在大肠杆菌中具有超宽的编辑窗口，是一种强有力的进化工具，可用于有效构建期望的细菌株系。

Fig6

为了比较不同Cas蛋白介导的CBE的编辑性能，作者将dBhCas12b介导的CBE与dSpCas9和dFnCas12a介导的CBE在E.coli中进行了比较（Fig7）。结果表明，dBhCas12b-CBE展现出更宽的编辑窗口(约43nt)，远超过其他两种CBE(约4-6nt)，dBhCas12b-CBE的编辑范围甚至超出了protospacer。

Fig7

最后，作者应用CRISPR-dBhCas12b-CBE进化双精氨酸转位酶(Tat)通路，作者设计了一个小型sgRNA库，分别靶向tatA、tatB和tatC基因，利用dBhCas12b-CBE对Tat途径相关基因进行突变，筛选出一株外源蛋白分泌效率提高6.49倍的E.coli JM109突变株，该突变株含有一个在protospacer外部的C₂₆突变，证明了CBE超出protospacer的编辑能力（Fig8）。综上所述，该新型dBhCas12b-CBE工具显著拓宽了基编辑的编辑窗口范围，为细胞进化筛选提供了新的强有力的基因组突变工具。

Fig8

通过工程化CRISPR-Cas12b，该研究开发了一种基于dCas12b的CRISPRi系统，可以有效抑制基因表达。并且基于dCas12b，建立了一代新型碱基编辑器，大大扩宽了编辑窗口，覆盖整个protospacer甚至超过，该新型BE在枯草杆菌和大肠杆菌中成功验证了其通用性。

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