LNP专题介绍（一）——核心成分：可电离阳离子脂质

脂质纳米粒Lipid nanoparticles（LNP）是关键、多功能的核酸（mRNA、siRNA及质粒DNA）递送技术。舒桐小编开设了LNP介绍专栏，将系统而全面的为读者解析LNP技术。

图1：LNP结构示意图

目前FDA批准的LNP配方都含有四种脂质:可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇 (PEG)-脂质偶联物，摩尔配比约为50 : 10 : 38.5 : 1.5。LNP结构示意如图1所示，具体描述为：阳离子脂质亲水头朝内与水溶性核酸静电相互作用，形成一个个反向胶束小囊泡；小囊泡再与外层脂质疏水链相互作用，形成类似双分子层的结构。

这种结构的形成，主要受可电离阳离子脂质的分子“形状”影响。我们知道，可电离的阳离子脂质一般含有叔胺头基，叔胺在中性条件下去质子化，并在低于脂质酸解离常数(pKa)的pH条件下带正电。可电离阳离子脂质是LNP产品中，最为关键的辅料成分，也是专利保护的核心点。

（1）核酸包封作用

可电离的脂质带正电，并通过与带负电的核酸聚合物磷酸主链的静电相互作用，促进核酸融入新形成的纳米粒中。

为了确保适当的可电离脂质质子化，LNPs需要在低于可电离脂质表观pKa值(通常为~ 6.5)的酸性pH(~4)下制备，然后进行缓冲液/pH交换步骤。由于可电离脂类通常被设计成疏水链尾部基团的横截面积大于亲水性头部基团的横截面积，因此这些脂类呈现出倒锥几何形状(图2)。根据分子形状假说，这有利于核内核酸周围的可电离脂质形成反向胶束堆积(图1)。

（2）可电离脂质的表观pKa调节转染效能

可电离脂质的表观pKa调节LNP介导的高效转染，LNP中测量的可电离脂质的pKa，pKa取决于其头基、疏水尾基和邻近脂质堆积的分子结构，甚至LNP的脂质组成（临近脂质成分）也会影响。有人研究，肝脏基因沉默活性与基于不同可电离脂质成分的LNPs的表观pKa有很强的相关性，在6.2和6.5之间达到最佳。

（3）可电离脂质可能是细胞内化的必要条件

可电离脂质也可能在内体摄取中发挥重要作用，要么直接通过一些可电离脂质上的正电荷与带负电荷的细胞膜之间的相互作用，要么通过与支持细胞摄取的血浆蛋白结合后转运。

载脂蛋白E（一种血浆蛋白，主要在肝脏和脑组织中合成，具有指导脂质转运的功能）在LNPs上的吸附使它们变成了被肝细胞吸收的仿生残余乳糜微粒。这一机制表明，进入血液的纳米药物上的蛋白质(APOE)电晕形成将不会成为递送药物的障碍，而是一种可以用于靶向的策略。

当使用可电离脂质/LNPs时表观pKa为6.4，根据Henderson-Hasselbalch方程，血液中约有10%的可电离脂质带正电(pH值为7.4)。可电离阳离子表面电荷不仅会影响蛋白冠的组成，也会对所吸附的蛋白构像产生影响，包括包括载脂蛋白E。总之，这些研究显示了纳米药物(包括LNPs)与生物分子(如生物学中的载脂蛋E)之间的相互作用生物体液，受表面成分、表面电荷和颗粒大小的影响

(4) LNP介导的内体破坏机制

一般情况下，细胞通过内吞作用吸收LNPs。随着核内体的成熟，pH值降低到低于可电离脂质的表观pKa值，其中很大一部分可电离脂质被质子化。有人认为，LNPs中的阳离子可电离脂质与内体膜中的阴离子脂质之间的静电相互作用导致内体膜的破坏，更具体地说，带相反电荷的脂质可能有助于将内体膜内的平面双层结构转变为更六边形的结构(倒立样微细胞结构，图2C)，从而破坏膜。阳离子脂质和阴离子脂质之间的相互作用，都驱动带电头基之间的静电相互作用。并通过它们的尾部/头部几何形状形成倒锥结构(图2B)。据报道，由于内吞循环，核酸货物逃离核内体的比例不到5%。可电离的脂质必须与细胞质溶胶中的核酸分离，以确保mRNA或siRNA分别适合翻译或沉默机制，这是一个具有挑战性的必要条件。

（5）可电离脂质可能在LNP耐受性和免疫原性中起作用

免疫原性的最佳脂质pKa在6.6 - 6.9之间(略高于转染时的典型最佳pKa(6.2-6.5) 表明脂质pKa独立于细胞质mRNA传递，可能在配方与免疫系统的相互作用中发挥作用。虽然基于LNP的免疫激活过程可以支持疫苗的功效，但LNP介导的免疫反应可能对治疗性核酸治疗不太有吸引力。

永久带正电的脂类的毒性和某些可电离脂类的免疫原性正在推动在LNPs中开发可降解的可电离脂质，用于疫苗以外的核酸递送。有研究者强调这种毒性几乎完全来自头基。用酯键取代双键产生水解裂解产物，这些产物很容易被纳入分解代谢途径，而不会失去效力。这种含有酯键的可生物降解的可电离脂类在给药后，在啮齿动物和非人灵长类动物中表现出快速的消除和排泄，以及良好的耐受性。

图2：应用于COVID-19 LNP疫苗产品的可电离阳离子脂质成分（A）；脂质填充理论解释两亲化合物（如DSPC和可电离脂质）的分子形状与其自组装结构的几何形状之间的关系；（C）带电的可电离脂质介导内体破坏的机制（内体低pH下，内体上阴离子脂质和LNP中可电离阳离子头基相互作用）。