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全基因组脱靶检测：全面评估基因编辑风险

舒桐科技

2024-10-18

导读：与GUIDE-seq体内检测相比，全基因组脱靶检测不依赖于ODN插入，提供了一种更加灵活和方便的检测方法。并且能够分析染色体大片段的变异，为您全面评估基因编辑的效果和风险提供帮助。

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基因编辑在治疗基因疾病有巨大的应用前景，但脱靶效应仍然是其临床应用的一项关注点。美国食品药品监督管理局（FDA）和国家药品监督管理局药品审评中心（CDE），要求基因编辑进行临床应用时必须仔细考察基因编辑工具的脱靶效应。研究人员已经发现CRISPR/Cas9的脱靶通常是sgRNA依赖型的，除了编辑靶向位点外，sgRNA还可以容忍高达5～6个错配碱基，或者在sgRNA缺少或含有额外碱基的基因组位点导致非靶向切割，产生脱靶效应。这些潜在脱靶的位点在基因组上有成千上万个。因此，如何全面评估全基因组范围内的脱靶效应就成为一个挑战。今天小编向大家一项基于全基因组测序和生信预测，实现在整个基因组分析脱靶效应导致的单核苷酸突变（SNV）、插入缺失变异（Indels）、拷贝数变异（CNV）和结构变异（SV）的技术。

近年来，基因组测序已经广泛应用于脱靶检测。Kevin等人 (2021)用全基因组测序和生信分析评估了Cas9的脱靶风险。他们对163个sgRNA在基因编辑小鼠与对照小鼠中进行了基因组序列和结构变异的比较。然后利用Cas-OFFinder预测了这163个sgRNA在基因组中的556266个潜在脱靶位点，通过将变异信息和潜在脱靶位点进行交集分析，他们检测到了28个脱靶位点，其中9个通过Sanger测序验证为真实的脱靶位点（图1）。这项研究表明虽然真实脱靶只占潜在脱靶的很小一部分，但风险仍然存在，不可忽视。

图1.小鼠全基因组脱靶检测流程。来源：Peterson, Kevin A., et al. BioRxiv (2021): 2021-08.

基于基因编辑的脱靶特性，舒桐研发团队结合基因组测序推出全基因组脱靶检测服务（图2）。我们采用mutect2作为变异分析工具，通过比对基因编辑组和对照组的测序数据，鉴定基因编辑组的SNV和Indels变异。此外，我们采用了Cas-OFFinder作为潜在脱靶位点预测工具，Cas-OFFinder能够分析sgRNA和基因组之间的匹配和凸起情况，预测可能的脱靶位点。通过将mutect2的变异分析结果与Cas-OFFinder的预测潜在脱靶位点去交集，可以确定发生编辑的脱靶位点（图3）。

图2. 舒桐全基因组脱靶检测流程

图3.基因编辑组脱靶位点的变异散点图。点的高度代表变异等位基因频率，箭头代表在靶位点。

除了脱靶效应的分析，我们还使用CNVkit和manta两种生信分析工具，CNVkit能够识别基因组中的拷贝数变化，而manta能够检测插入、缺失和易位等染色体结构变异类型。这些结果有助于全面了解基因编辑造成的染色体结构变异（图4）。

图4.基因编辑组全基因组变异概览。最内圈为结构变异，蓝色代表插入、黄色代表缺失、黑色代表易位；中间两圈代表拷贝数变异，靠内一圈的代表log2(copy number ratio)，靠外一圈代表拷贝数增加（绿色）和减少（红色）的区域；最外圈代表SNV和Indel变异的等位基因频率。

与GUIDE-seq体内检测相比，全基因组脱靶检测不依赖于ODN插入，提供了一种更加灵活和方便的检测方法。并且能够分析染色体大片段的变异，为您全面评估基因编辑的效果和风险提供帮助。舒桐科技是国内首家提供脱靶检测服务的公司，可提供全基因组脱靶检测、GUIDE-seq体内脱靶检测、AID-seq脱靶检测等多种服务。如有需要，欢迎垂询。

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。目前，舒桐科技拥有3000㎡的GMP研发实验室及生产车间；拥有博士后科研工作站及澳门理工大学教学科研实习基地。研发团队熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等，成功完成如基因敲除、点突变、大片段插入、过表达等细胞系构建项目；开发了多种具有自主知识产权的脱靶检测技术，建立了高通量的sgRNA筛选平台；建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR。公司目前已申请基因编辑、脱靶检测、新型CRISPR及药物递送等专利70+项，授权50+项。同时，公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐科技坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。