Detect-seq——CBE脱靶检测技术

在基因编辑领域，碱基编辑技术因为不产生双链断裂（double-stranded breaks, DSBs），有望用于治疗基因疾病。但在临床应用前，需要仔细评估其特异性。哈佛大学David Liu实验室先后开发了3种不同的碱基编辑器^[1]，分别是胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor, CBE)、腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor, ABE)和引导编辑器(Prime Editor, PE)。对于CBE的特异性研究，最新的方法是Detect-seq（dU-detection enabled by C to T transition during sequencing）体外脱靶检测技术。在介绍Detect-seq之前，我们先来复习一下CBE的原理。

胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE）由dCas9蛋白、sgRNA、胞嘧啶脱氨酶（cytidine deaminase）、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂（uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI）这4个成分组成，它们在细胞内完成组装，形成融合蛋白。融合蛋白在sgRNA的引导下与基因组DNA结合，并使靶序列暴露出单链结构，然后胞嘧啶脱氨酶将单链上的胞嘧啶(C)脱氨变成尿嘧啶(U)，进而通过DNA复制或修复将U转变为胸腺嘧啶(T)，最终实现C-G碱基对到T-A碱基对的直接替换。

图 1 胞嘧啶碱基编辑器的原理^[2]

利用了CBE过程中会产生中间产物脱氧尿嘧啶（dU）这一特点，研究人员开发了名为Detect-seq的CBE体外脱靶检测技术。该技术首先需要提取碱基编辑后的细胞的基因组DNA，然后将CBE产生的dU进行生物素（biotin）标记，用于富集目的片段；同时在dU位点的下游，将正常胞嘧啶C替换为5-醛基胞嘧啶（d5fC），随后d5fC被丙二腈化学标记为T，这样测序时就能发现很多串联的C-to-T的突变，根据这些明显的信号特征，就能快速定位碱基编辑的位点。

图 2 Detect-seq的检测原理^[3]

与GUIDE-seq、Digenome-seq和Cas-OFFinder相比，Detect-seq技术灵敏高、特异强、检测无偏好性，除了能检测Cas9依赖型和非依赖型的脱靶，还能检测sgRNA结合区域外编辑（out-of-protospacer edits）及靶向链编辑（target-strand edits）上的脱靶^[4]。

图 3 Detect-seq的技术路线^[3]

舒桐科技在过去的2年中打造了一站式基因编辑安全性评估平台，覆盖了靶点设计、靶点筛选、GUIDE-seq脱靶检测（cellular-based assays）、AID-seq脱靶检测（biochemical assay）、Detect-seq脱靶检测、脱靶验证、PEM-seq染色体重排检测、载体插入位点检测（升级版LM-PCR及液相杂交捕获测序）、克隆扩增分析、转录组脱靶检测、WGS脱靶检测等多种不同管线。此外，舒桐实验室具有SGS认证、ISO9001质量体系认证、生物安全二级实验室等资质认证，可持续稳定的为客户提供优质、高效、安全的服务及产品。

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。目前，舒桐科技拥有3000㎡的GMP研发实验室及生产车间；拥有博士后科研工作站及澳门理工大学教学科研实习基地。研发团队熟练掌握各类基因编辑技术，包括基因编辑、碱基编辑及先导编辑等，成功完成如基因敲除、点突变、大片段插入、过表达等细胞系构建项目；开发了多种具有自主知识产权的脱靶检测技术，建立了高通量的sgRNA筛选平台；建立了工厂化新型CRISPR挖掘体系，已开发出多种切割效率高且低脱靶的新型CRISPR。公司目前已申请基因编辑、脱靶检测、新型CRISPR及药物递送等专利70+项，授权50+项。同时，公司具备先进的CGT原料规模化生产能力，产品质量达到领先水平，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐科技坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。

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参考文献

[1] Anzalone AV, Koblan LW, Liu DR. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol. 2020;38(7):824-844. doi:10.1038/s41587-020-0561-9

[2] Rees HA, Liu DR. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells [published correction appears in Nat Rev Genet. 2018 Oct 19;:]. Nat Rev Genet. 2018;19(12):770-788. doi:10.1038/s41576-018-0059-1

[3] Lei Z, Meng H, Lv Z, et al. Detect-seq reveals out-of-protospacer editing and target-strand editing by cytosine base editors. Nat Methods. 2021;18(6):643-651. doi:10.1038/s41592-021-01172-w

[4] Lei Z, Meng H, Rao X, Zhao H, Yi C. Detect-seq, a chemical labeling and biotin pull-down approach for the unbiased and genome-wide off-target evaluation of programmable cytosine base editors. Nat Protoc. 2023;18(7):2221-2255. doi:10.1038/s41596-023-00837-4