点击蓝字 关注我们
杜克大学团队在《Cell Genomics》发表重磅研究，利用CRISPR表观基因组编辑技术成功重激活Prader-Willi综合征患者体内的沉默基因，为这一罕见遗传病开辟了精准治疗新路径。
疾病背景：被“表观锁”困住的基因
Prader-Willi综合征（PWS）是一种复杂的神经发育疾病，影响全球约1/15,000新生儿。
分子机制：患者的15号染色体上：
父源等位基因缺失或失活（约70%病例为缺失）
母源等位基因完整但被DNA甲基化"锁定"
关键基因如SNRPN、SNORD116等无法表达
这种现象被称为基因组印记，是表观遗传学的经典案例。
CRISPR 高通量筛选发现 PWS 调控元件
Tech.
该研究的第一步是通过CRISPR高通量筛选，定位到了PWS基因区域的关键调控元件。研究人员设计了覆盖整个15号染色体PWS区域的gRNA文库，筛选出了能显著调控母源基因（SNRPN）表达的关键区域。结果表明，父源和母源等位基因在调控区的作用存在显著差异，这些发现为后续的表观遗传编辑打下了坚实基础。
(A–B): 设计了覆盖 chr15 PWS 区域（约300 kb）的 gRNA 文库，包含 11,751 条 gRNA。
(C): 实验流程图：在带 GFP 报告基因的 iPSC 系统中进行 CRISPRa（激活）和 CRISPRi（抑制）筛选。
(D): 筛选结果显示父源（pat）和母源（mat）等位基因在调控区有显著不同。
(E–F): 单个或组合 gRNA 验证实验，显示特定区域（pat4、mat1、mat2）确实能影响 SNRPN 表达。
不同效应器的比较：VP64 vs. Tet1
Tech.
研究人员尝试了两种不同类型的CRISPR效应器来激活沉默的基因：VP64和Tet1。
VP64通过增强转录因子的作用，激活了母源SNRPN基因的表达，但效果较为短暂。
相较之下，Tet1通过去除DNA甲基化，重新打开了沉默的基因区，并且能够维持较为长期的激活效果。
这项研究揭示了CRISPR技术在基因治疗中的巨大潜力，尤其是在长期基因激活方面
(A): WT 与 PWS 缺失型 iPSC 的示意图。
(B–D): 用 VP64dCas9VP64（转录激活）或 Tet1v4dCas9（DNA 去甲基化）靶向 mat1、mat3 区域后，SNRPN 表达上调。
(D–E): RNA-seq 差异分析，显示不同效应器激活的基因谱不同。
(F–H): HCR-FlowFISH 实验证实，母源 SNRPN 和下游非编码 RNA（如 SNHG14）被重新激活。
表观遗传编辑：改变染色质状态，激活基因
Tech.
进一步的研究通过使用CUT&RUN和ATAC-seq等技术，探究了表观遗传编辑对染色质结构的影响。结果表明，Tet1处理后，PWS区域的染色质发生了明显的变化，更加开放，这为基因的表达提供了空间。这些实验结果证明，去甲基化不仅仅是激活基因的“开关”，它还会影响染色质结构，进而改变基因的转录活性。
(A): CUT&RUN和ATAC-seq显示，WT与PWS iPSC在PWS-IC区域的组蛋白修饰和染色质开放度的差异。
(B): WT 样本中，PWS-IC区域表现出H3K4me3（转录激活标志）和H3K27ac（活跃增强子标记）等表观遗传标记。
(C): 在PWS缺失型iPSC中，PWS-IC区域存在显著的H3K9me3（转录抑制标记）和 DNA 甲基化，这与基因沉默相关。
(D): 使用 Tet1（DNA 去甲基化效应器）处理PWS iPSC，观察到PWS-IC区域的H3K4me3和H3K27ac标记的显著增加。
(E): ATAC-seq数据显示 Tet1 处理后，PWS-IC 区的染色质开放度显著提升，表明 Tet1 去甲基化 使得该区域变得更加活跃。
(F): RNA-seq数据进一步验证了，Tet1处理后SNRPN以及下游基因的表达水平显著增加。
(G): ChIP-seq 结果显示，Tet1的作用不仅限于H3K4me3和H3K27ac的变化，也包括 转录因子的结合（如 CTCF、Pol II）。
(H): 组合实验显示，Tet1的作用导致染色质更为开放，且转录因子的结合增强，进一步促进 PWS 基因的转录激活。
长期激活：短暂去甲基化即可稳定基因表达
Tech.
其中最引人注目的发现是，短暂的Tet1表观遗传编辑在神经元分化过程中能够长期稳定地维持SNRPN等基因的激活。这项技术为PWS的治疗提供了全新的可能性，不仅能激活基因，还能在不同细胞类型中维持其长期的转录活性。
(A): 实验流程图：在 DPWS iPSC 中短暂导入 Tet1v4dCas9 → 分化为神经元 → 检测基因和表观遗传状态。
(B): 短暂导入 Tet1 后，iPSC 中 SNRPN 激活。
(C): 分化后神经元仍维持 SNRPN、MAGEL2、NDN 等基因激活。
(D–E): 甲基化检测显示，PWS-IC 区存在稳定的 去甲基化，并能在神经元分化过程中保持。
sgRNA筛选细节抓取
Tech.
SNRPN-2A-GFP报告细胞系构建
研究团队通过CRISPR-Cas9同源重组，在SNRPN基因的第10外显子插入P2A-sfGFP序列。
关键技术细节
使用P2A核糖体跳跃肽避免融合蛋白的潜在问题
分离获得父源和母源特异性标记的克隆
通过流式细胞术验证印记状态的维持
验证结果
父源标记细胞系：GFP阳性（基因活跃）
母源标记细胞系：GFP阴性（基因沉默）
双模态分布确认了印记的完整性
设计完整的gRNA文库
高密度核心区域（300kb）
范围：PWS印记中心上下游各150kb
密度：约每30-50bp一个gRNA
包含元件：
◀ PWS印记中心（PWS-IC）
◀ AS印记中心（AS-IC）
◀ SNRPN全部外显子和内含子
◀ SNORD116/115 snoRNA簇
◀ 已知的长非编码RNA基因
外围靶向区域
依据：H1人胚胎干细胞的DNase I超敏位点数据
覆盖：15q11-13全区域（chr15:23,692,325-26,425,399）
策略：仅靶向具有开放染色质特征的区域
意义：捕获远程调控元件和组织特异性调控序列
文库质量控制
总gRNA数：11,751个
非靶向对照：531个（来源于验证的全基因组CRISPRi文库）
脱靶评分：使用gt-scan算法排除高脱靶风险的gRNA
合成质量：通过深度测序验证文库的均一性
CRSIPRi和CRSIPRa筛选
细胞系：
patSNRPN-2A-GFP iPSCs稳定表达dCas9-KRAB/ matSNRPN-2A-GFP iPSCs稳定表达dCas9-VP64
相关参数：
MOI = 0.2确保单细胞单gRNA
文库覆盖度：430倍（确保统计检验力）
选择压力：1μg/mL嘌呤霉素持续7天
时间动力学考量
培养9天：确保稳定的表观状态建立
每日监测：细胞密度和荧光分布
关于舒桐
如需获得更多信息，请咨询我们：
电话：
400-6309596
18437963580（同微信）
企业官网：
http://www.generulor.com.cn
产品订购/技术支持：
service@generulor.com