随着基因治疗技术的快速发展，载体整合安全性评估已成为细胞与基因治疗（CGT）产品监管的核心议题。蓝鸟生物Skysona产品的安全性警报再次提醒我们，载体整合位点检测（ISA）不仅是技术问题，更是关乎患者生命安全的重大挑战。
一
CGT产品载体整合安全性风险：
现实的警钟
细胞与基因治疗作为现代生物医药领域的前沿技术，为攻克遗传性罕见病及多种难治性疾病提供了革命性的策略。然而，这类创新疗法在展现巨大治疗潜力的同时，其长期安全性风险评估也成为业界关注的焦点。
载体整合风险主要体现在三个方面：
基因功能干扰风险表现为基因失活、转录干扰、远程调控效应、反义RNA干扰等。当载体随机插入基因组时，可能影响正常基因的表达和功能。
插入性致癌风险是最严重的安全隐患。病毒载体在宿主基因组中随机插入可能导致原癌基因激活或抑癌基因失活，引发癌症风险。这一风险在蓝鸟生物Skysona产品的临床应用中得到了严峻验证。
长期安全性的不确定性则体现在载体插入的长期影响具有高度不可预测性，包括迟发性效应、累积性风险、载体激活风险、遗传风险等。
图1. 载体插入可能引发的致癌风险
Skysona安全性警报：行业的深刻反思
2024年10月发表于《新英格兰医学杂志》（NEJM）的研究报告显示，在接受蓝鸟生物Skysona（eli-cel）治疗的67名患者中，有7名被诊断出血液系统恶性肿瘤，包括骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）。
这些恶性肿瘤的发生具有明显的延迟性，诊断时间点分布在接受治疗后的1.2年至7.7年之间1。
这一发现促使FDA在2024年11月发布安全通讯，并在2025年8月7日正式批准针对Skysona药品说明书的强制性更新，增加黑框警告（Boxed Warning），强制规定所有接受Skysona治疗的患者必须进行至少15年的长期安全性随访。
二
全球监管指导原则解读：
从分散到统一的演进历程
FDA指导原则：逐步完善的监管框架
FDA在载体整合检测方面的监管经历了从基础安全检测到精准风险评估的发展历程：
EMA指导原则：系统化标准建立
欧洲药品管理局（EMA）在载体整合检测方面采用了更为系统化和标准化的方法。其发展历程虽然相对较短，但影响深远。
2015年5月20日至8月31日的征求意见稿阶段，EMA发布了《Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products》征求意见稿，这是对2001年版本的重大修订，首次系统性加强了载体整合检测要求。
2018年3月27日最终版的发布则成为了全球基因治疗监管的里程碑文件。该指导原则全面系统化了载体整合检测要求，详细规定了插入性突变评估的三步方法，建立了基因毒性研究标准框架。
NMPA快速跟进：中国特色的监管路径
中国国家药品监督管理局（NMPA）在基因治疗监管方面展现了快速学习和本土化适应的特点。从2021年到2024年的短短四年间，NMPA建立了相对完整的基因治疗产品监管体系。
NMPA指导原则特别强调，对于整合性载体基因治疗产品，建议申办方分析基因治疗载体在靶细胞或相关替代细胞的基因组中整合的影响，包括是否存在克隆性生长、是否存在优势克隆、克隆性生长是否导致恶性肿瘤等。
三
全球获批案例解读：
从理论到实践的验证
AAV载体产品：相对安全但仍需严格监测
全球已获批的8个AAV载体基因治疗药物从2012年Glybera到2024年Beqvez，涵盖了AAV1、AAV2、AAV5、scAAV9、AAVrh74等不同血清型。这些产品在整合风险方面相对较低，但仍需要进行严格的整合位点检测。
以Roctavian为例，其非临床研究采用液相杂交捕获法进行ISA检测，在18只非人灵长类猴子肝脏中检测到整合频率为0.48%，平均整合位点密度为1.55×10⁻³ IS/细胞，癌基因整合率≤0.59%。重要的是，所有组别的前10个最频繁位点均占比<4.2%，证明无克隆扩增风险。
慢病毒载体产品：高风险下的严格监管实践
慢病毒载体由于其高效整合特性在CAR-T细胞治疗等领域发挥重要作用，但同时也面临最高的整合风险。Skysona作为慢病毒载体产品的典型代表，其临床监测方案为行业提供了重要参考。
技术方案设计：Skysona采用S-EPTS/LM-PCR方法进行ISA检测，同时监测载体拷贝数(VCN)、相对频率(RelFreq)和寡克隆性观察。这是FDA推荐的慢病毒载体整合检测金标准。
监测时间的长期规划：治疗后前5年每6个月进行详细的ISA检测；治疗后6-15年每年进行ISA检测，每6个月进行全血细胞计数分析。一旦通过ISA检测发现持续整合位点相对频率高于10%的患者，需要接受更密切的监测以观察可能与克隆扩增相关的临床症状。
风险评估的严峻现实：Skysona的ISA结果揭示了慢病毒载体的潜在风险。在数据截止日期的最近一次评估中，血液肿瘤患者(N=7)的当前寡克隆性发生率为100%，持续寡克隆性发生率为86%，这与恶性肿瘤的发生密切相关1。
四
载体整合位点检测方案：
技术创新与标准化
慢病毒载体整合检测：LM-PCR技术的优化升级
2024年11月14日，FDA举办的病毒整合位点检测研讨会明确确认LM-PCR为慢病毒载体整合检测的最佳方法。这一技术的核心原理是基于LTR序列作为已知锚点，利用Tn5-LM-PCR技术直接扩增LTR与宿主基因组连接区域。
舒桐科技在此基础上优化升级推出了Tn5 LM-seq技术相比传统方法具有显著优势。Tn5转座酶建库技术避免了中间片段的非特异性拼接，从根本上减少了假阳性率问题，这是传统连接酶建库方法的主要痛点。UMI（分子标记）精准定量技术的引入，提供了更准确的整合位点频率分析，有效支持克隆性评估。双端检测能力使得可以同时检测3'LTR和5'LTR的整合位置，使整合位点检测更加全面和可靠。同时也经过严格的方法学验证，检测灵敏度可达0.001%，能够准确识别低频整合事件
检测结果关键分析指标：该技术平台可精确统计每个整合位点的相对频率，并基于国际标准进行寡克隆性评估。寡克隆性判断标准包括：至少1个整合位点相对频率≥10%，或2个或更多整合位点相对频率≥5%。通过对整合位点频率分布的深度分析，能够及时识别潜在的克隆性增殖风险，为临床安全性监测提供关键数据支撑。
技术流程的标准化包括：DNA提取和质量控制、Tn5转座酶处理和片段化、特异性引物扩增、高通量测序、生物信息学分析等关键步骤。每个步骤都有严格的质控要求，确保检测结果的准确性和重现性。
图2 舒桐科技Tn5 LM-seq检测原理示意图
AAV载体整合检测：TES技术的标准建立
AAV载体由于其随机整合特性且无特定锚点序列，检测技术面临更大挑战。舒桐科技推荐采用TES（Targeted Enrichment Sequencing）液相捕获测序技术进行全基因组筛查。
液相杂交捕获技术基于核酸序列特异性杂交原理，通过设计覆盖质粒全长的高特异性探针，捕获含有质粒-宿主基因组连接区域的DNA片段。与传统单点PCR不同，全长探针设计策略能够全面覆盖质粒各功能区域，包括复制起点、抗性基因、启动子、增强子等调控元件，确保对完整质粒整合、部分整合、串联整合和基因重排等复杂整合事件的准确识别。
多项研究表明，相比S-EPTS和WGS等方法，TES检测结果更符合剂量效应趋势，是检测AAV整合位点插入的最佳方法。舒桐科技建立了成熟的探针合成技术平台，可为客户免费制备定制化TES捕获探针，1-3天内完成交付，显著提升检测服务的便捷性和时效性。
关键检测指标体系包括：整合频率（游离DNA vs 整合DNA比例）、整合位点数量（总整合位点和唯一整合位点统计）、基因组分布（染色体分布模式分析）、癌基因相关性（与已知癌基因的邻近程度评估）等多个维度。
图3. 舒桐科技液相杂交捕获检测原理示意图
转座子与外源质粒：特殊载体的检测策略
转座子整合位点检测技术基于ITR序列作为已知锚点进行设计。由于转座子具有明确的末端重复序列，可以通过双端ITR检测确保转座子的完整性和整合位点的精确定位。因此Tn5 LM-seq方法也特别适用于Sleeping Beauty、PiggyBac等转座子系统的安全性评估。
外源质粒整合位点检测则面临更复杂的情况。质粒随机整合至基因组时可能发生重排或片段化，产生多种整合形式。因此也需要采用TES液相捕获测序技术，设计覆盖质粒全长序列的捕获探针，检测所有可能的整合形式，包括完整整合、部分整合、重排整合等。
五
行业发展趋势与未来展望
监管趋势：向精准化和智能化发展
从监管发展趋势来看，全球监管机构正在从基础安全检测阶段向临床风险评估阶段演进，监管一体化、技术标准化、风险评估智能化将成为载体整合检测领域的发展主线。
舒桐科技2025年的成功案例显示，标准化的载体整合位点检测已成为IND获批的关键要素。连续8项IND获批的关键成功因素包括：早期安全性评估规划介入、多方法联合验证策略、标准化数据分析流程，以及与监管机构的积极沟通。
技术发展：多元化平台的协同进步
载体整合位点检测不仅是技术挑战，更是基因治疗产品安全性评估的核心环节。随着技术不断成熟和监管要求日趋完善，舒桐科技建立了标准化检测技术平台、制定了明确的安全性评估标准和质控体系，将为基因治疗产品的临床前研究、监管申报和上市后监测提供全面技术支撑，确保产品开发全周期的载体整合安全性管控。
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参考文献
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