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CRISPR-Cas9技术已成为基因编辑领域的革命性工具，其核心优势在于其高特异性、可编程性及操作简便性。尤其是来自化脓链球菌的SpCas9（Streptococcus pyogenes Cas9），因其高效的DNA切割能力和广泛的适用性，被应用于基础研究、农业改良和基因治疗。然而，SpCas9仍存在一些局限性，例如脱靶效应、免疫原性以及对特定PAM序列的依赖，这些限制了其在临床和工业中的应用潜力。
传统的解决方案包括从自然界中挖掘新的Cas变体或通过定向进化优化现有蛋白，但这些方法往往受限于自然进化的保守性，难以突破功能瓶颈。近年来，人工智能（AI）技术的兴起为蛋白质设计提供了新思路。通过大规模语言模型（Language Models, LMs）学习蛋白质序列的进化规律，可以生成自然界中不存在的功能性蛋白，从而绕过自然进化的限制。
在这篇发表于《Nature》的研究中，作者团队提出AI驱动的蛋白质语言模型（Protein Language Models, PLMs） 新范式：通过大规模学习自然界的CRISPR序列多样性，直接生成超越进化约束的高性能编辑器。其中，利用AI技术设计的一种全新的CRISPR基因编辑器——OpenCRISPR-1，其编辑效率与特异性均优于天然SpCas9，且免疫原性更低。实验验证显示，OpenCRISPR-1在人类细胞中表现出卓越的编辑能力，同时兼容碱基编辑系统。这一成果不仅拓展了CRISPR工具库，也为未来基因编辑技术的优化提供了新范式。
一
核心实验与结果
1、AI生成多样化的CRISPR-Cas蛋白
研究团队首先构建了CRISPR-Cas Atlas（一个包含510万CRISPR相关蛋白的数据库），覆盖了26.2 Tbp的基因组和宏基因组数据。基于这一数据库，研究人员训练了两种LMs：一种针对广泛的CRISPR-Cas蛋白家族，另一种专门针对Cas9蛋白。通过无条件生成（随机生成）和条件生成（基于特定蛋白片段引导生成）两种方式，模型生成了480万CRISPR-Cas蛋白序列，其中Cas9-like蛋白占比显著。
重要结论：
序列多样性大幅提升：生成的Cas蛋白在70%序列相似性阈值下，聚类数量是天然蛋白的4.8倍，尤其是Cas12a和Cas13家族的多样性提升了6-8倍。
结构预测验证功能性：AlphaFold2预测显示，81.65%的生成蛋白具有高置信度结构，且核心功能域（如HNH、RuvC核酸酶域）保存完好。
RNA兼容性设计：通过训练专门的gRNA模型，成功设计了与生成Cas9蛋白匹配的sgRNA，验证了AI生成系统的完整性。
2、AI设计Cas9-like蛋白的系统发育与功能验证
研究团队从生成的Cas9-like蛋白中筛选了54万条序列，与天然Cas9构建系统发育树，并通过AlphaFold2预测其结构。此外，针对10种已知基因编辑效应的Cas9蛋白，设计了匹配的sgRNA，并通过t-SNE分析验证其与天然sgRNA的相似性。
重要结论：
系统发育多样性：生成的Cas9蛋白覆盖了天然Cas9未探索的进化分支，序列相似性仅为56.8%，但保留了关键功能域。
结构保守性：即使序列差异显著（最低25.8%相似性），生成蛋白仍能折叠成与天然Cas9类似的结构。
sgRNA设计的普适性：AI设计的sgRNA与天然sgRNA在二级结构和兼容性上高度一致，支持跨物种RNA交换。
3、OpenCRISPR-1的高效基因编辑与低脱靶效应
从生成的Cas9-like蛋白中筛选出48个候选蛋白，在HEK293T细胞中测试其编辑效率（靶向HEK3、HEK2等位点）和脱靶效应（通过SITE-Seq全基因组分析）。同时，与天然Cas9、高保真变体及其他设计方法（如共识序列、祖先重建）进行对比。
重要结论：
高效编辑：OpenCRISPR-1在NGG PAM位点的编辑效率与SpCas9相当，但在非NGG位点活性显著降低，显示更高的PAM特异性。
低脱靶率：OpenCRISPR-1的脱靶编辑比SpCas9减少95%，且全基因组分析显示其切割事件更集中于靶位点。
免疫原性降低：iELISA实验表明，OpenCRISPR-1与人类抗体的结合水平低于SpCas9，提示更低的免疫风险。
4、OpenCRISPR-1的扩展应用与优化
研究团队进一步测试了OpenCRISPR-1在碱基编辑中的应用，将其与ABE8.20腺苷脱氨酶融合，构建了新型碱基编辑器。同时，通过AI设计了14种sgRNA， 优化其与生成Cas9的匹配性。
重要结论：
碱基编辑兼容性：OpenCRISPR-1-ABE8.20系统在HEK293T细胞中实现35-60%的A-to-G编辑效率，与SpCas9相当。
sgRNA优化：AI设计的sgRNA可进一步提升编辑效率，部分变体的活性显著高于天然sgRNA。
全合成系统潜力：生成的腺苷脱氨酶（如PF-DEAM-1）与OpenCRISPR-1联用，展示了完全由AI设计的基因编辑系统的可行性。
二
结论与展望
本研究通过AI技术成功设计出OpenCRISPR-1，一种在编辑效率、特异性和免疫原性上均优于SpCas9的新型基因编辑器。这一成果的核心突破在于：
AI生成蛋白的多样性：打破了自然进化的限制，拓展了CRISPR工具库。
功能与结构的平衡：尽管序列差异显著，生成蛋白仍能保留关键功能域。
全系统设计能力：从Cas蛋白到sgRNA，AI实现了基因编辑系统的闭环优化。
未来，这一技术可进一步应用于：
定制化编辑器开发：针对特定PAM偏好、细胞类型或温度稳定性设计专用Cas蛋白。
临床转化：通过降低免疫原性，推动CRISPR技术在基因治疗中的安全应用。
合成生物学：构建完全由AI设计的生物系统，实现更复杂的基因调控。
OpenCRISPR-1的发布标志着基因编辑技术迈入AI驱动的新时代，为解决当前CRISPR技术的瓶颈提供了全新思路。
三
舒桐科技服务
舒桐科技产品：大肠杆菌重组表达的OpenCRISPR-1核酸酶（20μM）。蛋白质纯化获得分子量为159 KDa的高活性OpenCRISPR-1蛋白，体外切割实验显示具有体外切割活性。同时OpenCRISPR-1对靶DNA的切割活性与SpCas9基本一致。如对产品有需求，欢迎咨询！
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