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PNAS | MiniCasUltra解决AAV递送难题，效率提升6倍！

舒桐科技

2025-08-13

导读：舒桐公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案

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腺相关病毒（AAV）因其非致病性、高效转染能力、低免疫原性以及广泛的器官趋向性，成为基因治疗领域最受欢迎的递送载体之一。然而，传统CRISPR-Cas系统（如SpCas9、Cas12a等）的蛋白尺寸较大（通常超过1,000个氨基酸），接近AAV的包装极限，导致载体容量不足以同时容纳Cas蛋白、sgRNA及其他调控元件，严重限制了其在临床治疗中的应用。

近年来，研究人员致力于开发更紧凑的CRISPR-Cas系统，如Cas12f（原Cas14）家族，其蛋白尺寸仅为传统Cas9的一半左右，但仍存在编辑效率低、PAM（protospacer adjacent motif）限制严格等问题。例如，Un1Cas12f1仅识别5′-TTTR（R=A/G）PAM，极大限制了其基因组覆盖范围。

本研究介绍的MiniCasUltra通过理性设计优化Un1Cas12f1，显著提升了编辑效率（较Un1Cas12f1提高6倍），并扩展了PAM兼容性（5′-WBTR，W=A/T，B=T/C/G），同时保持了高特异性和低脱靶效应。此外，其超紧凑尺寸（仅529个氨基酸）允许在单个AAV载体中同时递送MiniCasUltra和双sgRNA，实现了高效的多基因编辑。这项研究不仅解决了紧凑型核酸酶在效率与靶向范围上的瓶颈，还为AAV递送的基因编辑疗法提供了更优的工具，尤其适用于需要多基因调控的复杂疾病治疗。

核心实验与结果

MiniCasUltra核酸酶的设计与编辑效率优化

研究团队基于Un1Cas12f1的三元复合物（sgRNA:Un1Cas12f1:DNA）结构分析，对其关键功能域（PAM相互作用区、催化RuvC域、靶核酸结合域）进行定点突变，引入带电荷或大侧链的氨基酸以优化DNA结合与切割活性。通过Gaussia荧光素酶报告系统（pSSA）评估双链DNA切割效率，并结合NHEJ（非同源末端连接）和HDR（同源定向修复）报告系统（GFP和BFP-to-GFP转换）全面评估编辑性能。

重要结论：

组合突变（RRAFW）使编辑效率提升6倍，与SpCas9水平相当。
NHEJ效率与SpCas9相当（~13%），而HDR效率虽低于SpCas9，但显著优于Un1Cas12f1和CasMINI V3.1。
在内源位点编辑中，MiniCasUltra表现稳定，编辑效率接近SpCas9，且倾向于产生较大片段缺失（10-20 bp），与传统Cas9的短indel（1-2 bp）不同。

PAM兼容性扩展与基因组覆盖提升

研究团队通过单核苷酸变异PAM测定法（SNV-PAMDA）系统测试MiniCasUltra对Un1Cas12f1经典PAM（5′-TTTA）所有单点突变的识别能力，并结合生物信息学分析计算其在人类基因组中的潜在靶点覆盖率。

重要结论：

MiniCasUltra的PAM偏好扩展至5′-WBTR（W=A/T，B=T/C/G），理论靶点覆盖率从Un1Cas12f1的11.8%提升至47.1%。
在124个内源位点测试中，66%的位点编辑效率超过20%，证明其广泛适用性。
与AsCas12f1、enOs-Cas12f1等其他紧凑型CRISPR系统互补，可覆盖更全面的基因组区域。

高特异性与低脱靶风险验证

通过Cas-OFFinder预测脱靶位点，结合GUIDE-Seq（全基因组双链断裂定位）和PEM-Seq（染色体易位分析）在细胞和小鼠模型中评估MiniCasUltra的特异性。

重要结论：

MiniCasUltra的脱靶编辑率极低（1.22-3.48%），特异性比率（on/off-target）显著优于Un1Cas12f1和CasMINI V3.1。
GUIDE-Seq显示，MiniCasUltra仅产生1个高频脱靶位点，而Un1Cas12f1和CasMINI V3.1分别产生6个和2个。
PEM-Seq显示，MiniCasUltra染色体易位风险极低（仅1例），而SpCas9为7例。

单AAV递送实现体内双基因编辑

将MiniCasUltra与靶向Pten和Fah基因的双sgRNA包装至AAV8载体（肝趋向性），通过尾静脉注射递送至小鼠肝脏，通过深度测序和ELISA评估编辑效率及蛋白表达水平。

重要结论：

单AAV递送实现Pten和Fah的高效编辑（15.8%和29.4%），分别较CasMINI V3.1提升4.6倍和2.7倍。
蛋白水平显著降低，且未检测到肝毒性或炎症反应。
脱靶分析显示所有预测位点的编辑频率均低于0.75%，与对照组无显著差异。

MiniCasUltra治疗脉络膜新生血管（CNV）的潜力

在激光诱导的CNV小鼠模型中，通过AAV9递送MiniCasUltra靶向人源VEGFA（非经典PAM 5′-TCTG），通过荧光血管造影（FFA）、光学相干断层扫描（OCT）和视网膜电图（ERG）评估治疗效果。

重要结论：

视网膜编辑效率达26.95%，VEGFA蛋白水平显著降低。
CNV病变面积减少，血管渗漏改善，内视网膜功能部分恢复。
仅1个脱靶位点，证实其治疗安全性。

实验结论

MiniCasUltra通过结构优化、PAM扩展和递送革新，解决了紧凑型CRISPR系统在效率、靶向范围和临床应用上的关键瓶颈，为基因治疗（尤其是AAV递送场景）提供了更优工具。其低脱靶特性和多基因编辑能力，使其在复杂疾病（如多基因代谢病、视网膜病变等）治疗中具有突出潜力。这一成果的核心突破在于：

编辑效率显著提升：MiniCasUltra的基因编辑效率较Un1Cas12f1提高6倍。
PAM兼容性大幅扩展：识别范围从Un1Cas12f1的5′-TTTR扩展至5′-WBTR（W=A/T，B=T/C/G）。
高特异性与低脱靶风险：MiniCasUltra的脱靶编辑率极低，且安全性更高。
单AAV递送实现高效多基因编辑：超小尺寸允许在单个AAV载体中同时包装MiniCasUltra和双sgRNA。

舒桐科技服务

舒桐科技可以提供从AAV质粒设计、构建、包装至表达分析的全套服务。不仅如此，舒桐科技也可以提供全面的AAV载体和表达系统，用于体内和体外表达human/mouse/rat ORFs，lncRNA、circRNA、shRNAs和CRISPR/gRNA。舒桐科技生产的AAV具有滴度高、纯度高和稳定性高的三高优点。如对产品有需求，欢迎咨询！

舒桐科技AAV产品优势：

载体全：多种组织特异性启动子和多种报告基因可供客户选择。
货期短：AAV克隆载体均与我们18,000个预制人源ORF cDNA克隆MCS区通用，行业中生产周期短。
滴度高：可提供10¹²VG/ml及以上滴度的病毒，可高达10¹⁴VG/ml。
服务优：可根据客户具体实验，由公司专业技术人员提供载体构建方案，提供特殊定制服务。

此外，舒桐科技在过去的2年中打造了一站式基因编辑安全性评估平台，覆盖了靶点设计、靶点筛选、GUIDE-seq脱靶检测（cellular-based assays）、AID-seq脱靶检测（biochemical assay）、脱靶验证、PEM-seq染色体重排检测、载体插入位点检测（升级版LM-PCR及液相杂交捕获测序）、克隆扩增分析、转录组脱靶检测、WGS脱靶检测等多种不同管线。此外，舒桐实验室具有CNAS认证、SGS认证、ISO9001质量体系认证、生物安全二级实验室等资质认证，可持续稳定的为客户提供优质、高效、安全的服务及产品。

关于舒桐

珠海舒桐医疗科技有限公司是一家以基因编辑为核心技术的生物医药企业，总部位于粤澳深度合作区——横琴新区，下设鼓润（武汉）医疗科技有限公司、广州舒桐医疗科技有限公司和杭州舒桐生物科技有限公司等全资子公司。公司为国家高新技术企业，拥有博士后工作站和多个博士后团队，已申请专利40余项，承担多项国家科技重大专项。公司致力于通过创新技术为多种疾病尤其肿瘤开展新药研发，提供基因靶向治疗方案。同时公司搭建了一站式基因编辑平台、分子诊断平台和科技服务平台，可提供从靶点筛选、基因编辑有效性检测到安全性评估的全流程解决方案；具备先进的CGT原料规模化生产能力，可为科研机构及生物医药企业提供安全高效的一站式服务和原料供应。舒桐医疗坚持以“创新、敬业、融合、开放”为核心价值观，致力于利用基因治疗技术造福人类健康，让生命更美好。