是不是又转化失败了？珍贵的质粒、漫长的筛选流程，结果却毁在第一步？这不仅是你的困扰，更是绝大多数丝状真菌研究者的真实写照！高达80%的转化失败案例，其根源并非载体设计或筛选条件，而在于原生质体制备这一基础环节。今天，我们就将这道关键“坎”夷为平地，带你揭秘高效制备的全流程核心秘籍！

丝状真菌作为一类极具工业价值的微生物菌株，在食品发酵、酶制剂生产、生物医药合成及环境污染物降解等领域发挥着不可替代的作用。从传统酿造行业中米曲霉用于酱油、腐乳的发酵，到现代生物工程里黑曲霉高效合成糖化酶、柠檬酸，再到里氏木霉生产纤维素酶助力生物质能源开发，丝状真菌凭借其强大的代谢调控能力与产物合成潜力，已成为工业生物技术领域的 “核心力量”。

随着基因工程技术的快速发展，通过基因编辑、代谢工程等手段改造丝状真菌菌株，进一步提升产物产量、优化发酵性能，成为推动相关产业升级的关键方向。而原生质体制备作为丝状真菌基因操作的基础前提，其制备效率与质量直接决定了后续转化、编辑及菌株改造的成功率，是连接基础科研与工业应用的重要技术环节。

针对黑曲霉、米曲霉、木霉等工业常用丝状真菌，本文将系统梳理出原生质体的高效制备流程，同时深度剖析实验过程中高频出现的技术疑问，指出实验关键操作的 “避坑要点”，小伙伴们快来一起看看吧！

· 供试菌株：黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、产黄青霉等丝状真菌（建议选用活性稳定的实验室保藏菌株，冻存菌株需提前复苏并传代 2 次确认活性，工业菌株需结合生产需求筛选适配菌株）。

· 培养基：

o 活化用：YPD或PDA 培养基（灭菌后倒平板，4℃保存备用，有效期 1 周，用于菌株复苏与活性验证）。

o 增殖用：液体种子培养基（含碳源、氮源及无机盐，调节适宜 pH 后灭菌，为菌丝快速生长提供营养，满足后续酶解需求）。

o 再生用：在液体种子培养基基础上添加渗透压稳定剂（如蔗糖）及琼脂，灭菌后制成平板，为原生质体再生细胞壁、形成菌落提供环境。

· 渗透压稳定剂：STC 缓冲液（含蔗糖、Tris-HCl、CaCl₂，采用过滤除菌，不可高温灭菌，4℃避光保存，有效期 7 天，维持原生质体形态稳定，防止破裂或皱缩）。

· 酶解体系：含复合酶（纤维素酶、溶壁酶等，按菌株细胞壁特性调整酶组合比例）及 Tri-H缓冲液（调节至适宜 pH，现配现用，全程冰浴操作，保证酶活性，高效降解菌丝细胞壁）。

· 辅助试剂：PEG4000（50% 浓度母液，过滤除菌，介导原生质体膜融合，助力外源 DNA 进入）、台盼蓝染液（快速检测原生质体活性，判断实验效果）、甘油（15-20% 浓度，用于原生质体长期冻存，减少低温损伤）、线性化质粒 DNA（纯度达标，适配转化需求，携带目标编辑基因）、筛选用抗生素（按质粒标记基因选择，配制成母液保存，筛选成功转化的菌株）。

1. 取少量菌株孢子（或菌丝块）接种至 PDA 固体培养基，28℃倒置培养 72h，待平板上长出均匀绒毛状菌丝及少量孢子，确认菌株活性良好。

2. 用无菌接种环挑取活性合格的菌丝块，接入装有液体种子培养基的三角瓶中，28℃、180rpm 振荡培养 24h，通过显微镜观察确认菌丝处于对数期（形态完整、无老化空泡，保证酶解效率）。

1. 采用无菌纱布过滤菌液，收集培养好的菌丝，用无菌超纯水反复冲洗 3 次，彻底去除残留的培养基成分（避免杂质影响酶解效果，降低原生质体纯度）。

2. 将洗涤后的菌丝转移至无菌滤纸上，轻轻吸干表面水分，按 “1g 菌丝配 10mL 酶解液” 的比例，准备后续酶解反应（水分过多会稀释酶浓度，影响细胞壁降解效率）。

1. 用无菌剪刀将菌丝剪碎成短片段，放入无菌容器中，加入现配的酶解液，确保菌丝完全浸没，置于 30℃、80rpm 恒温振荡环境中进行酶解。

2. 酶解过程中，每 30min 取少量酶解液进行显微镜观察，当视野中出现大量圆形、透亮的原生质体时，立即加入 2 倍体积的 STC 缓冲液终止酶解（通常酶解时间为 2-3h，避免酶解过度导致原生质体破裂，活性下降）。

1. 将终止酶解后的混合液通过 300 目无菌尼龙网过滤，去除未完全酶解的菌丝碎片，收集含原生质体的过滤液。

2. 将过滤液转移至无菌离心管，4℃、4000rpm 离心 5min，弃去上清液，保留底部原生质体沉淀；向沉淀中加入 STC 缓冲液，轻轻吹打重悬，重复离心洗涤 2 次，获得纯净的原生质体（减少酶解液残留，避免影响后续转化）。

1. 取少量纯化后的原生质体，用 STC 缓冲液稀释后，与台盼蓝染液按 1:1 比例混合，室温放置 5min 后显微镜观察：活的原生质体不被染色（呈透亮状），死的原生质体被染成蓝色，活性需≥80% 方可用于后续实验。

2. 采用血细胞计数板对原生质体进行浓度计数，通过显微镜观察并计算，将原生质体浓度调整至 10⁷-10⁸个 /mL，满足转化实验对细胞浓度的需求。

· 立即转化：将活性与浓度合格的原生质体置于冰浴中，2-8h 内完成 PEG 介导的转化实验（此时间段内原生质体活性最高，转化效率最优）。

· 短期保存：若暂不进行转化，将原生质体分装至无菌离心管，4℃冷藏保存，12-24h 内使用（超过 24h 原生质体活性会显著下降，影响实验结果）。

1. 取 100μL 制备好的原生质体悬浮液放入无菌离心管，冰浴 10min，使原生质体处于稳定状态。

2. 向离心管中加入 10μL 线性化质粒 DNA，轻轻混匀后继续冰浴 20min，促进外源 DNA 与原生质体膜结合。

3. 缓慢加入 200μL 50% PEG4000 母液（沿管壁滴加，避免剧烈冲击），轻轻颠倒离心管 5 次混匀，室温放置 15min，利用 PEG 的融合作用助力 DNA 进入原生质体。

4. 向离心管中加入 800μL STC 缓冲液，终止 PEG 作用，4℃、4000rpm 离心 5min，弃去上清液；用 1mL STC 缓冲液重悬沉淀，再次离心洗涤 1 次，彻底去除残留 PEG（避免 PEG 与后续抗生素协同损伤原生质体）。

5. 用 200μL STC 缓冲液重悬最终沉淀，将其均匀涂布在含抗生素的再生培养基平板上，28℃倒置培养 48-72h，观察并挑取生长出的转化子菌落，进行后续鉴定与筛选。

1. 菌丝选择孢子转接还是菌丝传代？

优先选择孢子转接，孢子萌发形成的菌丝更幼嫩，细胞壁结构疏松，酶解时更容易降解，原生质体产量与活性更高；对于孢子产量极低的特殊菌株（如部分工业突变株），可采用菌丝片段传代，但需严格控制培养时间≤20h，确保菌丝处于对数期，同时调整酶解体系（如增加几丁质酶比例），保证酶解效果。

2. 酶解后原生质体产量低、活性差怎么办？

· 排查菌丝状态：确认液体培养时间是否过长（超过 24h 易导致菌丝老化）、振荡转速是否过低（低于 150rpm 会造成菌丝缺氧，生长不良），需严格控制培养条件，保证菌丝处于旺盛生长状态。

· 检查酶解液：确认酶制剂是否在有效期内（过期酶活性会大幅下降）、配制过程是否全程冰浴（室温会导致酶失活）、酶浓度比例是否适配菌株（不同菌株需调整酶组合），必要时更换新鲜酶制剂重新配制。

· 确认渗透压：检测 STC 缓冲液与酶解液中稳定剂浓度是否适宜（如蔗糖浓度偏离 1.2M、NaCl 浓度异常），渗透压失衡会导致原生质体破裂或皱缩，需重新配制试剂并验证浓度。

3. 转化后无转化子生长，常见原因有哪些？

· DNA 质量问题：质粒未进行线性化处理（环状 DNA 转化效率远低于线性化 DNA）、DNA 纯度不达标（OD260/OD280 未在 1.8-2.0 范围内，含蛋白酶、核酸酶等杂质会破坏 DNA），需重新制备线性化、高纯度的质粒 DNA。

· PEG 作用异常：PEG 浓度偏离 50%（过高会导致原生质体死亡，过低无法有效介导融合）、作用时间不当（短于 10min 结合不充分，长于 20min 毒性积累），需严格控制 PEG 浓度与作用时间，操作时缓慢滴加。

· 抗生素添加问题：PEG 未洗涤干净就加入抗生素（PEG 与抗生素协同作用会损伤原生质体）、抗生素浓度过高（抑制原生质体再生），需确保 PEG 彻底洗涤，提前通过预实验确定适宜的抗生素浓度。

4. 原生质体保存后活性下降，如何规避？

· 短期保存：4℃冷藏环境下，原生质体活性稳定时间不超过 24h，需在有效期内使用；保存过程中避免反复从 4℃取出置于室温（温度波动会破坏原生质体膜结构，导致活性下降），建议分装为小体积，单次用完。

· 长期冻存：建议现做现用，长期保存必须添加 15-20% 甘油作为保护剂（无保护剂会导致低温下形成冰晶，损伤原生质体），冻存时需采用程序降温（1℃/min），不可直接放入 - 80℃冰箱（快速降温会加剧细胞损伤）；解冻时快速水浴复苏，解冻后立即使用，禁止反复冻融。

1. STC 缓冲液严禁高温灭菌，高温会导致蔗糖焦化、成分变性，失去渗透压稳定作用，必须采用 0.22μm 滤膜过滤除菌，4℃避光保存。

2. 酶解液需现配现用，全程冰浴操作，酶制剂不可长时间暴露在室温环境中，室温放置超过 2h 会导致酶活性显著下降，影响细胞壁降解效率。

3. 菌丝洗涤需彻底，残留的培养基成分（如葡萄糖、蛋白胨）会抑制酶活性，降低酶解效果；吸干菌丝水分时动作要轻柔，避免用力挤压导致菌丝断裂，影响后续酶解反应。

4. 酶解过程中振荡转速需控制在≤80rpm，转速过高会产生剧烈冲击，导致已形成的原生质体破裂；镜检监控不可省略，需根据原生质体释放情况及时终止酶解，防止过度酶解。

5. 离心纯化时，温度需稳定在 4℃（低温可保护原生质体活性），转速严格控制在 4000rpm，离心时间 5min，转速过高或时间过长会造成原生质体损伤、活性下降。

6. 转化实验中，DNA 体积不可超过反应体系的 10%，过量 DNA 会稀释体系浓度，影响原生质体与 DNA 的结合效率；PEG 需沿管壁缓慢滴加，避免快速倒入导致原生质体凝集，无法正常转化。

（一）基因敲除服务针对单个目标基因：设计 sgRNA，利用 CRISPR/Cas9 系统诱导 DNA 双链断裂，通过非同源末端连接（NHEJ）修复途径实现基因敲除，研究基因功能。

（二）多基因敲除：设计多个 sgRNA，同时对多个基因进行敲除，研究基因之间的相互作用以及代谢途径的调控网络。

（三）基因敲入： 通过同源重组（HR）修复途径，将外源基因或特定 DNA 片段插入到目标基因位点，实现基因的敲入。

（四）碱基编辑服务：

· 胞嘧啶碱基编辑（CBE）：利用胞嘧啶碱基编辑器，实现胞嘧啶（C）到胸腺嘧啶（T）的转换，无需 DNA 双链断裂和供体 DNA。 

· 腺嘌呤碱基编辑（ABE）：通过腺嘌呤碱基编辑器，将腺嘌呤（A）转化为鸟嘌呤（G），实现碱基的精准编辑。