文 / 宋岩、刘天红、窦微、曲大鹏、郑权，中国科学院长春光学精密机械与物理研究所、长春新产业光电技术有限公司
全固态激光器（Diode Pumped all-solid-state Laser，DPL）具有体积小、效率高、光谱线宽窄、光束质量优、可靠性好等优点，在生物仪器领域，如基因测序、单细胞分选、数字PCR、光遗传、光动力、光声成像、共聚焦显微等有广泛的应用。
基因测序
基因测序是指分析特定 DNA 片段碱基排序，达到获得生物遗传信息的目的。基因测序采用链终止法，在 DNA 转录末端引入带有荧光标记的寡核苷酸，此时 DNA 被分成了长度不同的单链，再使其通过激光聚焦光束，不同荧光素便会发出不同颜色荧光，达到标记核苷酸排序的目的。作为最重要的生物学分析方法之一，DNA 测序不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。
在基因测序仪中，一次完整的测序需要连续运行很长时间，此时激光器的参数如果出现任何一个问题，如能量抖动、噪声、跳模或指向性变化，都可能导致数据无效。从激光束中生成一个衍射极限的光斑并不困难，但是符合这种级别的光束分离和精准定位要求的光学系统，必须具备优异的光束质量和波长稳定性，消除引擎中激光器的相干性，避免生成斑点，以确保仪器的精度与可靠性。
图 1 是专为高通量基因测序推出的四波长全固态激光器，使用自动功率反馈控制，主动的温度控制功能保证输出波长高度稳定，无任何跳模现象 , 同时具有瓦级功率、优于 0.5% 高稳定性、超低噪声、优异的光斑均匀性以及波长锁定等特点。这种高功率的全固态激光器可以极大提高 DNA 测序速度，将单次基因测序的成本降至千元人民币以内。
图 1 GEN 系列全固态激光器
单细胞分选
包括流式和拉曼两种分选技术。
（1）流式细胞术
流式细胞术通过检测对悬浮于流体中的微小颗粒标记的荧光信号进行高速、逐一的细胞定量分析和分选 , 原理见图 2。
图2 流式细胞仪原理图
流式细胞仪是一种对异质细胞群中的细胞进行多参数分析或分选的有力工具，可用于免疫分型（白细胞）、倍体分析（DNA）、细胞计数以及 GFP( 绿色荧光蛋白 ) 表达分析等一系列应用。目前普遍用于流式细胞仪的激光器有 360 nm、488 nm、505 nm、515 nm、532 nm、552 nm、561 nm 和 594 nm 等。
（2）拉曼精准分选技术
拉曼精准分选技术将拉曼光谱、荧光标记、图像分析等多种细胞识别方法相结合，可实现功能性 / 特异性单细胞的分选与分析。与传统的流式细胞分选技术相比，该技术不对细胞进行任何“修饰”，即可实现精准分选，可最大程度保持细胞本来的状态；同时，对不同类型、尺寸的细胞具有良好的普适性，可应对各种性状的复杂生物样本，特别适用于微生物单细胞分选。为研究细胞异质性、原位观察细胞功能、探索细胞与环境间相互作用提供有力工具。拉曼单细胞精准分选仪一般采用 532 nm 全固态脉冲激光器。
数字 PCR
数字 P C R （ Polymerase Chain Reaction）是一种核酸分子绝对定量技术，一般包括两部分内容，即 PCR 扩增和荧光信号分析。通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子 (DNA 模板 )，在每个反应单元中分别对目标分子进行 PCR 扩增，然后通过特定波长激光来激发出通道中的荧光信号，在扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。
与荧光定量 PCR 相比，数字 PCR 优势是它不依赖于 CT 值，因此不受扩增效率影响，扩增结束后通过直接计数或泊松分布公式来计算每个反应单元的平均浓度 ( 含量 )，能够将误差控制在 5% 以内。数字 PCR 可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析。
数字 PCR 系统中一般使用 2-4 种波长的全固态激光光源（图 3），要求输出功率稳定性高并且功率要严格控制在某个特定范围内，以保证检测数据的真实准确可靠。
图3 数字 PCR 生物芯片阅读仪及内部激光器
光遗传
光遗传技术就是应用光来控制细胞的活性，已被证明是神经科学中一种潜力无穷的研究工具。该技术整合了光学、软件控制、基因操作技术、电生理等多学科交叉的生物工程技术。人们可以借助光遗传学技术对活体组织的特定细胞进行调控，开启或关闭某个已经被研究得非常清楚的细胞功能。
光遗传学应用系统（图 4）控制细胞的流程：首先向细胞内转入一个合适的光敏蛋白基因；以激光作为刺激媒介，在不同波长的激光照射刺激下达到对细胞选择性地兴奋或者抑制的目的（可以光纤输出局部刺激细胞，也可以空间光输出大范围刺激脑区）；最后收集输出信号，读取结果或者通过适当控制编程实现控制生物活动的效果。由于光敏蛋白中的 ChR2 和 NpHR 分别对473 nm 和 589 nm 波长的光敏感，所以使用双波长激光的组合比较多。
光遗传技术可以推广到所有类型的神经细胞，已经衍生出了几个富有前景的转化型研究领域，比如在神经病学的应用研究，可以用于眼病的治疗、神经修复学领域、心脏疾病、帕金森症等。
图4 光遗传学仪器
光动力
光动力治疗具有创伤小、毒性低、选择性好、适用性高等优点，其原理如图 5。应用一种给药方式给予光敏药物后，在一定时间间隔内采用特定波长的光源照射肿瘤部位；利用光敏药物的光敏化特性，使选择性聚集在肿瘤组织的光敏药物活化，在光源的激励下产生一系列的化学、物理、生物等光反应破坏肿瘤。新一代光动力疗法中的光敏药物会将能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧。单态氧能与附近的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性进而杀伤肿瘤细胞。
光源是保证光动力治疗顺利实施的必要因素之一。好的光源应该具备以下几个特点：（1）光波长处于光敏药物吸收峰附近；
（2）光源在使用过程中需要有一定的组织穿透性；
（3）光功率可调；
（4）激光的输出与光纤相结合使用，保证治疗靶向点更加精确等。总而言之，光动力治疗离不开高品质的激光光源，目前常用波长包括 457 nm、 532 nm、577 nm、589 nm等（图 5）。
图5 光动力疗法微视图和光纤耦合激光器
光声成像
光声成像是一种非入侵式和非电离式的新型生物医学成像方法，其原理如图 6。当脉冲激光照射到生物组织中时，组织的光吸收域将产生超声信号，我们称这种由光激发产生的超声信号为光声信号。生物组织产生的光声信号携带了组织的光吸收特征信息，通过探测光声信号能重建出组织中的光吸收分布图像。光声成像结合了纯光学组织成像中高选择特性和纯超声组织成像中深穿透特性的优点，可得到高分辨率和高对比度的组织图像，从原理上避开了光散射的影响，突破了高分辨率光学成像深度“软极限”（~1 mm），可实现 50 mm 的深层活体内组织成像。
图6 光声成像原理图
光声成像能够有效地进行生物组织结构和功能成像，为研究生物组织的形态结构、生理特征、病理特征、代谢功能等提供了重要的手段，特别适合于癌症的早期检测和治疗监控。用于光声成像的光源一般为 266 nm、355 nm、532 nm 和1064 nm 脉冲激光器。
共聚焦显微
激光扫描共聚焦显微的基本工作原理是首先由激光器发射一定波长的激发光，光线经放大后通过扫描器内的照明针孔光栏形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦平面上，样品上相应被照射点受激发而发射出荧光，通过检测孔光栏后，到达检测器，并成像于计算机屏上。这样由焦平面上样品的每一点荧光图像组成的一幅完整的共焦图像，称为光切片。
相对普通荧光显微，共聚焦系统有效地排除了焦点以外的光信号干扰，提高了分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间定位；由于能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构及特定分子、离子生物学变化的新途径。
中科院苏州医工所推出了一款小型的多路激光激发 - 多路探测通道的滤光片型共聚焦显微镜，如图 7 所示。可根据用户需要进行激光器数量和激光中心波长的选择。其中光源部分采用 4 波长激光单模光纤合束。
图7 共聚焦显微镜
小结
随着全固态激光技术的不断发展 , 生物用激光器已进入到批量仪器制造阶段，与我们的生活息息相关。除了上述应用领域以外，还有光镊技术、拉曼光谱仪、光致发光等。全固态激光技术是目前我国在国际上为数不多的从材料源头直到激光系统集成拥有整体优势的高技术领域之一，具备了加速发展的良好基础。在国家对激光产品自主研发的大力支持下，在未来的几年里，激光器在生物仪器及制造领域必将迎来一个更大的飞跃和发展。
注：文中图片皆由长春新产业集团客户提供
作者简介
宋岩，中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 / 长春新产业光电技术有限公司，工程师，主要从事激光与光机电一体化设备的研制与开发、自适应智能控制与机器视觉的研究。
刘天红，中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 / 长春新产业光电技术有限公司，高级实验师。
窦微，长春新产业光电技术有限公司，工程师。
曲大鹏，长春新产业光电技术有限公司，高级工程师。
郑权，中国科学院长春光学精密机械与物理研究所二级研究员，长春新产业光电技术有限公司总经理。
END
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