人类基因组的解读自古以来就备受科学家们的追求。随着现代生物技术的发展，基因测序作为解析生命密码的关键工具逐渐崭露头角。基因测序，又称DNA测序，是指分析特定DNA片段碱基排序，达到获得生物遗传信息的方法。DNA测序的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。基因测序的发展已经使得人类对遗传学有了更深入的理解，也为疾病的诊断、治疗和基因编辑等方面提供了重要的信息。基因测序采用链终止法，在 DNA转录末端引入带有荧光标记的寡核苷酸，此时DNA被分成了长度不同的单链，再使其通过激光聚焦光束，不同荧光素会发出不同颜色荧光，达到标记核苷酸排序的目的。
第一代基因测序技术（Sanger测序）是由桑格Sanger等人开创的双脱氧链末端合成终止法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化，基本方法是链终止或降解法。该方法随后改用荧光核苷酸标记、毛细管电泳区分和激光检测，从而实现了第一代自动化测序法。1977年，由桑格测定了第一个基因组序列——噬菌体phiX-174，全长只有5,375个碱基。虽然与今日的技术比起来根本不算什么，但自此之后，人类获得了窥探生命本质的能力，并以此为开端真正步入了基因组学时代。
第一代DNA测序技术测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但由于其高成本、低通量，极大影响了其大规模的应用。
经过技术的不断专研和改进，第二代测序技术（Next-generation sequencing，NGS）也应运而生。第二代测序技术不仅测序速度变得更快，还令测序成本大幅降低，且具备高准确性，在NGS之前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用 NGS 1周就足够了，但其缺点是序列读长方面要短很多，大多只有100bp-150bp。
第二代基因测序技术（NGS）凭借着高通量、低成本、测序时间短等优势，很快在全球测序市场中占据了主导地位，其应用领域包括无创产前检测（NIPT）、胚胎植入前遗传学诊断／筛查（PGD／PGS）、遗传病诊断、肿瘤诊断和个性化治疗、致病基因检测、病原微生物检测等。
以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术为标志，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，平均达到10Kb-15Kb，是二代测序技术的100倍以上。
并且理论上可以测定无限长度的核酸序列。 因此第三代测序技术又称为单分子DNA 测序，即通过现代光学、高分子、纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理，以达到直接读取序列信息的目的。不需要使用生物或化学试剂，能够进一步降低成本。
但目前第三代测序最大的缺陷是错误率较高（15-40%）。好在出错是随机的，并不会像NGS那样存在测序错误的偏向，所以能够多次测序进行纠错。
图4 PacBio SMRT测序原理（来源：Chris Miller）
以上，便是对各代测序技术做了简要的阐述。在此过程中，可以看到测序成本，读长，错误率和通量是评价一个测序技术先进的重要指标。
其实第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外，测序的核心原理都来自于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是通量大大提升，成本随着大大减低，但二代的缺点是其所引入的PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且测序过程中具有一定的系统偏向性，另外就是读长比较短，这会给后续的数据解读带来一定程度的困难和限制。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，虽然能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，而且也能够获得很高的读长，但这个技术还不是很成熟，需要再进化，目前成本也偏高。
2.激光与基因测序
在基因测序领域，激光技术扮演着重要的角色。激光的高度集中性和单一波长特性使其成为基因测序仪器中不可或缺的元素。通过激光技术，科学家们可以实现快速、精准地读取DNA序列信息，推动基因组学领域的发展。激光器与基因测序实际应用与举例如下几项技术简介：
单细胞测序技术： 单细胞测序是基因测序领域的前沿技术之一，它可以揭示不同细胞之间的遗传异质性。激光在单细胞测序技术中的应用至关重要。通过激光切割和激光诱导荧光技术，科学家们可以实现对单个细胞的基因组测序，揭示细胞之间的差异和功能。
基因编辑与CRISPR技术： 激光技术在基因编辑领域也发挥着关键作用。以CRISPR-Cas9为代表的基因编辑技术，需要精准的DNA修饰。激光切割技术可以帮助研究人员实现对DNA的精细修饰，从而实现更精确的基因编辑。
生物标记物检测： 激光在生物标记物检测中的应用也日益广泛。通过激光诱导荧光技术，科学家们可以标记特定的基因序列或蛋白质，实现对生物标记物的高灵敏检测，为医学诊断和疾病监测提供了重要手段。
激光扫描测序技术：激光扫描测序技术是一种高通量测序技术，通过利用激光在DNA分子上的扫描来实现快速而准确的基因测序。这项技术在高通量测序中具有重要意义，能够快速测序大量基因信息。
激光捕获测序：激光捕获测序是一种基于激光技术的高效测序方法，通过激光捕获靶向DNA片段，实现对特定基因区域的测序。这种方法在研究特定基因或基因组区域时具有高效性和准确性。
激光切割技术：激光在基因测序中还可以用于精确切割DNA分子，帮助实现对特定DNA片段的提取和测序。这种精细的操作可以提高测序的准确性和效率。
激光显微镜观察：激光显微镜在基因测序中的应用也很广泛，可以用于观察DNA分子的结构和特性，帮助科研人员更深入地理解基因组的组成和功能。
总的来说，激光技术在基因测序中扮演着重要的角色，不仅提高了测序的速度和准确性，也拓展了科学家们对基因组的研究深度。
3.激光器选择与定制
针对四种DNA核苷酸（ACGT）化学标记的荧光，激光是否可以高效激发，从而进一步是否可以精准地区分四种荧光染料，对于基因测序来说至为关键。所以，激光器的选择作为基因测序的关键一步直接影响其测量的准确性和高效性。
（1）激光波长：目前基因测序市场常用波长：488 nm、514 nm、532 nm、577 nm、639 nm、660 nm、690 nm......
针对四种DNA核苷酸（ACGT）化学标记的荧光，激光是否可以高效激发，从而进一步是否可以精准地区分四种荧光染料，对于基因测序来说至为关键。所以，激光器的选择作为基因测序的关键一步直接影响其测量的准确性和高效性。
（2）激光功率：mW级到W级。
针对DNA单链被高度放大、空间上高度集中类型的应用，荧光信号越强，相应的激光器功率就越低；
针对取样点遍布需要大面积照明的大型流动池或滑道中，较高功率就显得尤为重要；
由于短波长（如488nm）激光对样品产生功能性损伤，通常选择较低功率。
（3）稳定性：在基因测序实验和应用中，激光器的可靠性和长期功率稳定性至关重要。功率偏差大会直接影响整个数据集的测试结果。
图5 北京镭志威光电技术有限公司--4.4 h功率稳定性（均方根值）
图6 北京镭志威光电技术有限公司--1.1 h功率稳定性（均方根值）
（4）可定制的解决方案
在行业或科研实验中，不仅对激光器的光学参数有相应要求，而且针对特定的使用情形需要定制解决方案。简单一些的如光纤传输、光斑整形，复杂一些的如多波长合成，多个波长之间高一致性等等。
北京镭志威的系列激光器具有稳定性高、体积小、功耗低、风冷/传导散热等特点。目前，北京镭志威用于基因测序的激光器已实现量产，每年为测序仪制造商批量供货，可提供上述大部分特殊波长和各种功率，并可定制光学方案。除基因测序外，该系列激光器同时被广泛应用于PCR、流式细胞术、生物显微成像共聚焦成像、流式细胞仪、医学成像、试剂检测、血液透析等生物领域中。
图7北京镭志威光电技术有限公司--多波长激光器（可定制）
图8 北京镭志威光电技术有限公司--定制化激光器解决方案
1.激光技术在基因测序中的未来应用
（1）高通量测序技术的进一步发展
随着激光技术在基因测序中的广泛应用，未来可以预见高通量测序技术的进一步发展。新的激光扫描测序技术可能会出现更快速、更准确的测序方法，带来更高的测序吞吐量和更低的成本。这将有助于加速基因组学研究的进程，促进个性化医学和精准医疗的发展。
（2）单细胞测序技术的完善
激光技术在单细胞测序中的应用已经取得了重要进展，未来的发展方向可能包括提高单细胞测序的分辨率和准确性，拓展对单细胞基因组的全面分析能力。这将有助于揭示单个细胞在发育、疾病发生和治疗反应等方面的细微差异，推动个体化医疗的实现。
（3）激光显微镜在基因组学研究中的应用
随着激光显微镜技术的不断进步，未来可以预见在基因组学研究中对细胞和基因组结构的更深入理解。高分辨率的激光显微镜成像技术将为研究人员提供更详细的基因组信息，帮助揭示基因表达和调控的机制，为疾病诊断和治疗提供更精准的依据。
（1）多模态成像技术的兴起
未来，激光技术与基因测序的融合发展将推动多模态成像技术的兴起。结合激光显微镜成像和基因测序技术，研究人员可以实现对细胞和基因组的多维度、多尺度的全面观察，从而更全面地理解生命的复杂性。
（2）个性化医疗的实现
激光技术与基因测序的结合将为个性化医疗的实现提供重要支持。通过高通量测序技术和激光显微镜成像技术，医生可以更准确地诊断疾病、预测治疗效果，并制定个性化的治疗方案，为患者提供更精准、有效的医疗服务。
随着激光技术和基因测序技术的不断创新，未来的发展前景令人振奋。激光技术的应用将进一步提高基因测序的速度和准确性，降低成本，推动个性化医疗的发展。基因测序的普及也将为疾病的早期诊断和治疗提供更多可能性，助力健康医疗事业的进步。
张丽莹，研发工程师，德国耶拿大学硕士，主要从事激光光学设计及应用研究。
谭成桥，北京镭志威光电技术有限公司创始人及总经理，研究生毕业于中科院长春光学精密机械与物理研究所，07年创办北京镭志威光电，从事激光行业超过20年。
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