吕超林，琚志平，覃俭
引言
自20世纪下半叶共聚焦激光扫描显微镜发明以来，其在分辨率、图像质量以及功能等方面持续改进，应用范畴愈发广泛。时至今日，它已成为生命科学、医学、材料科学等领域至关重要的研究工具，并逐渐成为显微成像的金标准。
尽管双光子、多光子共聚焦激光显微镜正被日益追捧，（单光子）共聚焦激光显微镜凭借其简单易用的特性，依旧在市场中的占有重要地位。作为中高端科研仪器，共聚焦显微镜平均价格高达300万，全球共聚焦显微镜市场规模每年近10亿美元，徕卡、蔡司、奥林巴斯和尼康等国际厂商占据了九成以上的市场份额。
常见的共聚焦显微镜工作于可见光波段（400-700 nm），然而测试样品的异质性与复杂成分会引发严重的光散射以及自发荧光现象，对成像穿透深度和信噪比构成了限制，致使其长期被局限于细胞和薄片组织当中。一般而言，波长越长，散射越弱，自发荧光越少。通过将波段由可见光拓展至近红外（1000-2000 nm），能够有效降低光散射和自发荧光背景，从而实现深层成像，提高信噪比。
同时，相较于可见光，近红外波段具有良好的隐蔽性，能够在夜间以及恶劣气候条件下开展工作，并且涵盖了一些材料的光学指纹信息，在半导体检测、材料分类、太阳能电池监测、食品品质检测等应用中具备颇为可观的应用潜力。然而，尽管在理论上存在众多优势，由于该波长区域可使用的高性能光探测器和高亮度荧光探针受到限制，近红外波段共聚焦显微镜性能始终不如人意。
在过去的20年，量子信息领域蓬勃兴起，光探测器的性能在量子信息强有力的推动下实现了巨大飞跃，特别是超导纳米线单光子探测器 (SNSPD）的性能已接近光探测的极限。相较于共聚焦显微镜中常用的光电倍增管PMT，SNSPD在近红外波段的性能可以媲美，甚至超越PMT，比如超高的检测效率（>95%@1550 nm）、近乎为零的噪声（<10 Hz） 、超宽的探测波段（400-3000 nm）、更低的时间抖动（<50 ps）[1]。与此同时，国内外的研究人员也开发出了各式各样的近红外生物探针，涵盖有机小分子、碳纳米管、量子点和稀土纳米粒子等[2]。
因此，将近红外波段最前沿的探针和光探测器技术加以融合，我们有希望使共聚焦显微镜焕发出全新的活力，在全新的波段探索未知领域。本文将按照波段从近到远，阐述近红外波段共聚焦显微镜在活体生物成像、活体光学诊断、材料分析等应用领域的进展与趋势。
快速脑血流监测
1977年，杜克大学的Jibsis首次证实，在近红外光窗口（700-1000 nm）范围内能够进行无创脑监测，也就是借助近红外光在组织中的透射、反射等的时空变化来获取大脑中的生理特性，涵盖血液氧合、血流速、脑灌注压、水浓度、光散射等。
随后，研究人员发展出漫反射相关光谱DCS方法，即采用长相干长度的近红外激光照射组织，组织中的散射体如红细胞等对入射光进行调节并被探测器接收，随后所测得的时间强度自相关函数的衰减曲线能够反映出血流速等血液参数。
目前DCS所采用的波长一般为700-850 nm，通常因低信噪比而受到限制，只能在厘米量级的源探测器距离以及1 Hz的采集速率下运行。当把波长拓展至1050-1100 nm左右时，更多的光子数量以及较慢的自相关函数衰减，有助于大幅提升信噪比和采集速率。
2021年，美国哈佛医学院的Nisan0zana研究小组使用1064 nm波段的高性能SNSPD探测器搭建DCS系统，实现了16倍的信噪比增益，将采集速率提升到20 Hz[3]。 未来，SNSPD的引入还有望助力达成零源探测器距离，从而大幅提高空间分辨率。图1是漫反射相关光谱测量装置。
单线态氧检测
单线态氧属于最低激发态的分子氧，作为一种活性氧，能够有选择性地氧化有机物或者诱导癌细胞凋亡，在化学合成、聚合物降解、光动力疗法以及光动力抗菌等领域具有关键的应用价值。其中，光动力疗法是一种用于癌症和其他疾病的微创治疗手段，而单线态氧
被视作参与光动力疗法的主要细胞毒性物质。然而，
在溶液或者细胞中的寿命较短（小于1 μs），发光量子产率极低（10-6-10-8），并且发射波长位于红外波段的1270 nm，所以直接检测单线态氧的发光是一项充满挑战的任务。
2021年，俄罗斯Scontel公司与德国的Becker&Hickl公司展开合作，将共聚焦显微镜和SNSPD探测器有效结合，开发出一套全新的测量仪器，实现了细胞中单线态氧磷光信号的寿命成像[4]，见图2。
骨疾病早期诊断
骨骼系统，作为支撑生命架构的重要基础，不仅承担着身体的重量，还赋予我们活动的能力。骨骼的健康状况直接关系到机体的活动能力、防御体系的稳固程度以及代谢机制的正常运转，然而令人遗憾的是，像骨骼结构异常、骨质疏松、风湿性关节炎、退行性骨关节病以及骨骼肿瘤等骨骼系统疾病，往往隐匿不现，直到对个体的生活质量产生显著影响时才被发现。所以，寻求早期筛查和非侵入式评估的方法成为业内长期以来的需求。
由于骨髓中大量存在的巨噬细胞对近红外波段的稀土纳米荧光探针具有吞噬作用，促使血液中的稀土纳米荧光探针向骨髓组织转移，从而成为出色的靶向探针。通过向小鼠尾静脉注射发射波长在1500 nm的稀土荧光探针，经过3至5天，小鼠体内血管的信号消失，而骨骼的荧光信号达到最强峰值，能够清晰地观测到体内不同部位的骨骼影像，涵盖脊柱、胸骨、颅骨、胫骨、指骨、肋骨和股骨等。与x光影像对1 mm骨缺损的检查结果相比，二者分辨率相近，并且没有辐射等危害。同时，这种靶向性持续时间能够延长至2个月，有利于进行多次影像检查和病情监测[5]，见图3。
大深度脑血管成像
脑科学属于21世纪最具发展前景的领域之一，针对基础脑功能以及脑部疾病展开研究，对于人工智能、教育以及医疗的发展意义重大。脑成像技术是脑科学研究当中的关键工具，传统的计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）等技术，其空间分辨率相对较低（处于厘米量级），仅能用于确定粗略的结构以及功能变化。光学显微方法能够提供高分辨率和目标组织的特异性成像，使得生物结构以及单细胞层面上的细胞过程、事件和功能的研究具备了可能性，不过存在成像深度较浅这一问题。
2009年，斯坦福大学戴宏杰院士的团队借助具有近红外发射特性的单壁碳纳米管和近红外波段敏感的InGaAs相机，首次达成了大于1000 nm波段的活体生物成像，由此掀起了近红外波段光学生物成像技术的研究热潮[6]。随着波长进一步向长波方向移动，研究人员开始把SNSPD引入到共聚焦显微镜当中。2021年，康奈尔大学的chrisXu团队运用激发波长为1310 nm和发射波长为1700 nm的量子点探针以及高性能SNSPD探测器，展示了深度达1.7 mm的小鼠大脑的单光子共聚焦荧光成像[7]。
2022年，斯坦福大学戴宏杰院士团队采用激发波长为1650 nm和发射波长约为1880 nm的生物相容性核壳硫化铅/硫化镉量子点以及高性能SNSPD探测器，实现了1700-2000 nm范围内的单光子激发荧光成像窗口，并在完整的小鼠头部中达成了约1.1 mm的成像深度[8]，见图4。和PMT相比，成像深度提高将近2倍，信噪比高出一个数量级。
图4 近红外窗口中完整小鼠头部的无创活体共焦显微镜成像。(a)NIR-IIc 窗口中完整鼠头成像示意图；(b) 可视化的完整小鼠头部血管的三维体积图像；(c) 小鼠头部不同深度的血管的高分辨率共焦图像；(d) 对应 (c) 图中黄线的光子数分布图；(e) 通过共聚焦显微镜在不同深度记录xy图像的SBR比较
总结
综上所述，近红外波段具有低散射和少自发荧光的优势，可以很好地解决可见光波段共聚焦显微镜成像深度浅、信噪比低等问题。过去20年，随着光探测器和探针领域的进步，近红外波段共聚焦显微镜已经在大深度脑血管成像、骨骼疾病早期诊断、快速脑血流监测、单线态氧检测等应用中开始崭露头角。未来随着近红外波段光探测器和高效光学探针材料的迭代发展，将继续推动近红外波段光学影像技术向临床转化。
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