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近年来，CRISPR-Cas9 技术已成为功能基因组学实验室的标准工具，尤其在全基因组筛选中广泛应用。在谈及CRISPR全基因组筛选时，GeCKO（Genome-scale CRISPR Knock-Out）文库是一个不可忽视的名字。今天，我们将详细探讨：
1. GeCKO v2 文库的基本概念
2. 文库质粒扩增中的“高保真”操作为何至关重要？
3. 如何在实验室内完成高保真文库扩增？
一
GeCKOv2文库简介
GeCKOv2文库是一种广泛应用于基因敲除研究的全基因组sgRNA文库，包含人类和小鼠基因组的广泛数据。
· 物种覆盖：包括人类和小鼠两个版本的文库。
· 文库规模：
o 人源库：包含123411条sgRNA；
o 小鼠库：包含130209条sgRNA。
· 设计理念：文库主要靶向每个基因的早期外显子，旨在通过 CRISPR 介导的敲除，研究基因功能。每个基因的靶向 sgRNA 数量为 6 条，这些 sgRNA 被分布于两个子文库（Library A 和 Library B）中：
o Library A：每个基因 3 条 sgRNA；
o Library B：每个基因 3 条 sgRNA；
o 完整版文库：通过合并 A 和 B 两个子文库，确保每个基因有 6 条 sgRNA。
此外，两个子文库还包含约 1000 条对照 sgRNA，确保实验的可靠性和完整性。A 文库特别关注 miRNA 靶向，每个 miRNA 包含 4 条 sgRNA，便于进行非编码调控的研究。
载体系统方面，GeCKO v2 提供两种选择：
1. 单载体系统：lentiCRISPR v2，Cas9 和 sgRNA 在同一载体中，操作简便，但病毒滴度较低；
2. 双载体系统：lentiCas9-Blast + lentiGuide-Puro，适用于大规模筛选，但需要先建立稳定的 Cas9 表达细胞系。
二
为何文库质粒扩增如此讲究
GeCKO v2 是一个“混合文库”（pooled library），意味着在同一管 DNA 中，混合了成千上万种不同的质粒，每种质粒对应一个特定的 sgRNA。如果扩增过程中操作不当，容易导致以下问题：
· 文库失衡：某些构建被“偏好”扩增，导致其比例过高；
· sgRNA 丢失：部分 sgRNA 在扩增过程中丢失，导致实验数据不完整。
这种现象被称为文库瓶颈效应。为了避免这一问题，原始协议中对文库扩增提出了严格要求：
1. 必须使用电转化，而非常规化学感受态；
2. 必须采用大平板培养，而非液体摇瓶培养；
3. 必须确保至少50×的克隆覆盖度，即每个sgRNA至少有50个独立克隆；
4. 培养条件需控制在 32°C，以减少 lentiviral LTR 区域的重组风险。
三
GeCKO v2 文库扩增的具体操作流程
根据 GeCKO 原始协议，我们可以将关键操作分解为以下几个步骤：
Step 1：准备文库 DNA
· 将冻存的 GeCKO 文库质粒稀释至 50 ng/μL，并尽量减少冻融次数，以保证 DNA 质量。
Step 2：电转化高效电感受态细菌
· 选择电感受态细胞（例如，NEB DH5α），其转化效率要求≥10⁹ cfu/μg DNA；
· 每次电转化25 μL电感受态细胞与2 μL文库DNA，按推荐参数进行电转化。
Step 3：计算转化效率
· 为了确保文库的覆盖度，需要进行稀释板培养并统计菌落数。目标是获得至少 50× 的克隆覆盖度。
Step 4：大平板铺菌扩增
· 根据实验室条件选择合适的平板（10 cm 平板），确保菌液均匀铺展，并在 32°C 培养 14 小时，避免菌落进入衰亡期。
Step 5：收集菌落并制备大提样品
· 通过无菌刮刀收集菌落，将其转入 LB 悬液中并进行离心，得到细菌沉淀，随后使用商业化 Maxi 试剂盒进行大规模提取。
四
从文库到筛选：后续步骤与注意事项
在完成文库扩增后，下一步是进行慢病毒包装及筛选：
1. HEK293T/293FT 细胞共转染：
o 文库载体（如 lentiCRISPR v2 或 lentiGuide-Puro）；
o 包装质粒 psPAX2；
o 包膜质粒 pMD2.G。
2. 按照实验室生物安全规范进行慢病毒制备，确保文库的 sgRNA 分布均匀，避免缺失。
结语：每一步都是为高质量筛选奠定基础
对于很多新接触 GeCKO 的同学来说，可能会觉得文库扩增看似繁琐，但其重要性不容忽视。若在扩增阶段未能严格遵循规范，后续筛选结果的统计学意义将大打折扣。因此，严格按照原始 protocol 进行操作，不仅能确保文库质量，更为后续实验的成功提供了保障。
五
案例分享：GeCKO 文库的质量控制实践
在我们舒桐科技的实验室中，GeCKO v2 文库的质量控制是非常关键的一步。下面是我们对两种不同文库（A 和 B）的质量数据分析：
1. 文库 A 质量数据：
o Total sgRNA：63950
o Zero Counts：139
o Gini Index：0.09668
o Coverage (%)：99.7826%
o Depth：209.99
2. 文库 B 质量数据：
o Total sgRNA：56869
o Zero Counts：30
o Gini Index：0.08752
o Coverage (%)：99.9472%
o Depth：243.47
从这些数据可以看出，尽管两种文库的 sgRNA 数量 和 Zero Counts 有所不同，但它们都达到了高覆盖率（＞99%），确保了实验结果的可靠性。其 Gini Index 表明了更为均匀的 sgRNA 分布，极大减少了实验中的偏倚。这些质量控制数据证明了我们在文库扩增过程中严格遵守操作规程，从而保证了后续筛选和实验的统计学有效性。
参考文献：
1. Sanjana, N.E., Shalem, O., Zhang, F. "Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening." Nature Methods (2014).
2. Shalem, O., Sanjana, N.E., Hartenian, E., Shi, X., Scott, D.A., Mikkelsen, T., Heckl, D., Ebert, B.L., Root, D.E., Doench, J.G., Zhang, F. "Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells." Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005.
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舒桐科技搭建有CRISPR文库构建与筛选技术平台，严格遵循国际主流技术流程，并建立了完善的质控体系。平台提供从文库定制、扩增、质控到全基因组筛选的一站式解决方案，致力于保障高质量、高可信度的筛选数据产出。
一、 GeCKO v2 标准文库服务
· 标准文库质粒扩增与质控服务： 严格依据原始方案，采用电转化与大平板扩增技术，提供高保真的GeCKO v2 A/B库或混合库质粒。服务附带涵盖覆盖度、Gini指数与测序深度等指标的质控报告，确保文库代表性。
· 标准文库慢病毒包装与滴度测定： 基于HEK293T细胞进行GeCKO文库慢病毒包装，并提供准确的病毒滴度测定数据，为后续细胞感染实验提供可靠基础。
· 全基因组基因敲除筛选服务： 服务涵盖细胞培养、病毒感染（MOI优化）、抗性筛选至表型富集等完整流程。通过高通量测序与生物信息学分析，鉴定与特定表型相关的关键基因。
二、 定制化CRISPR文库服务
· 目标基因集定制文库构建： 针对特定通路（如激酶、表观遗传因子）、疾病相关基因集或代谢通路，可进行定制化sgRNA文库设计与合成，sgRNA规模灵活可调。
· 功能性元件筛选文库构建： 面向增强子、启动子等非编码调控元件或特定miRNA家族，提供CRISPRa/i或敲除文库的定制构建服务，用于调控机制发现。
· 全流程筛选项目承接： 支持从研究目标与细胞模型出发，完成文库设计、质粒库合成、病毒包装、细胞筛选、建库测序与数据分析的全流程项目执行。
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