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反义寡核苷酸（ASO）作为精准调控基因表达的核酸药物，已在神经退行性疾病、遗传病治疗领域崭露头角。然而，ASO药物开发的成败关键在于靶点的精准筛选和序列的合理设计。如何从海量候选位点中找到最优靶点？如何避开RNA二级结构的陷阱？体外验证时如何提高成功率？本文将结合实战经验，系统解答这些问题。
01
ASO作用原理与设计策略
ASO通过Watson-Crick碱基配对与靶RNA结合，主要利用RNase H降解mRNA或通过空间位阻调控剪接实现基因沉默。
图1. Gapmer ASO通过DNA缺口区招募RNase H1酶，在结合位点精准切割靶mRNA
有效ASO需要满足的关键条件:
（1）高特异性：与靶标RNA精准配对
（2）高亲和力：稳定的杂交结合
（3）低脱靶风险：避免非特异性结合
（4）良好成药性：核酸酶稳定性与细胞摄取
02
ASO靶点设计步骤
2.1 转录本信息收集与注释
全面收集靶基因的转录本信息，为后续位点筛选提供基础。
关键步骤:
（1）从RefSeq、GENCODE数据库获取所有已知转录本变体
（2）标注5'UTR、CDS、3'UTR、内含子、外显子等结构域
（3）识别起始密码子、终止密码子、polyA信号、剪接位点等功能元件
实战提示:
同一基因可能有多个转录本变体，需要确认在目标组织中的主要表达形式，避免设计的ASO无法覆盖实际表达的转录本。
2.2 RNA二级结构预测与可及性评估
RNA二级结构直接决定ASO能否“接近”靶点。使用RNAfold等工具基于最小自由能算法预测二级结构，计算每个候选位点的单链概率和局部解链自由能。
实战经验提示:
l 优先选择环（loop）、凸起（bulge）等单链区域
l 避开茎区（stem）——这些区域即使设计出ASO，结合效率也很低
l 关注位点周围±10 nt的结构稳定性
l 避免高度结构化区域(ΔG < -8 kcal/mol)
2.3 基于作用机制的位点选择
RNase H介导的mRNA降解是最常用的ASO机制。
优先区域:
l 编码区(CDS)中后段
l 3'UTR前半部分
位点筛选要求:
l 避开强二级结构区域,选择单链可及性高的位点
l 考虑位点在核内和胞质中的可及性差异
l 避开起始密码子附近100 nt（翻译起始复合物保护）
l 远离剪接位点±20 nt(除非目标是剪接调控)
化学修饰推荐:
采用Gapmer设计(DNA缺口+2'-MOE或LNA翼区)，这是目前临床验证最成熟的设计模式
03
序列设计与优化要点
3.1 序列长度与GC含量
推荐序列长度：16-25 nt（过短特异性不足，过长易聚集）
GC含量控制：40-60%是黄金区间
GC过高（>60%）:非特异性结合↑,易形成G-四联体
GC过低（<40%）:结合亲和力↓,Tm值偏低
3.2 避免不良序列模式
(1) 连续G碱基（≥4个）:可能形成G-四联体结构，导致非特异性蛋白结合
(2) CpG基序：尤其是CpsG（C-PS-G键），可能激活免疫系统——这在体内实验中可能引发意外的免疫反应
(3) 长同聚物序列：如AAAA、TTTT，会降低特异性
(4) 强自互补区域：使用OligoEvaluator检测发夹结构、二聚体，避免ΔG < -3 kcal/mol的区域
3.3 热力学参数优化
Tm值：推荐50-70°C
结合自由能（ΔG）：确保ASO-mRNA杂交足够稳定，但也不能过强导致难以解离
不同修饰对Tm的影响
化学修饰对Tm的影响:
l 2'-OMe修饰:每个修饰约提升Tm 0.5°C
l 2'-MOE修饰:每个修饰约提升Tm 1.0°C
l LNA修饰:每个修饰约提升Tm 3-8°C
图2. 常用化学修饰类型
3.4 脱靶风险初步评估
评估方法:
在全基因组及全转录组范围内检索是否存在连续16个碱基匹配的序列，且该序列位于基因或转录本上。
风险分级:
l 0-5个基因:低风险
l 5-20个基因:中风险 (需进一步细胞验证)
l 20个基因:高风险 (建议更换靶点)
工具推荐：
NCBI BLAST或Ensembl BLAST，参数设置为高敏感度。
04
珠海舒桐ASO设计服务
珠海舒桐采用自主开发的智能设计平台，整合多维度生物信息学算法，为您提供从靶点筛选到序列优化的一站式ASO设计服务。我们的设计策略基于FDA批准药物的成功经验，确保每条候选序列都具备高活性、高特异性、低毒性的特点。
完整设计流程七大步骤：
Step 1: 靶基因获取与转录本注释
操作内容:
l 自动获取目标基因的所有转录本变体(RefSeq/GENCODE/Ensembl)
l 标注5'UTR、CDS、3'UTR、外显子/内含子边界
l 识别剪接位点、起始密码子、终止密码子等关键区域② 滑窗算法全覆盖扫描
Step 2: SNP位点规避
l 数据来源: UCSC dbSNP数据库
l 规避原则: ASO序列中的任何一个碱基如果位于已知SNP位点，都可能导致:
部分人群ASO与靶mRNA结合亲和力下降、药物疗效个体差异显著、临床开发失败风险增加等
Step 3: 滑窗算法生成候选ASO库
算法原理：使用滑窗算法对靶基因的反向互补序列进行全覆盖扫描
l 使用滑窗算法生成所有候选ASO
l 自动标注外显子/内含子/UTR区域
l 对于5 kb mRNA,可生成约5000条初始候选序列
初步筛选:
l 排除GC含量<35%或>65%的序列
l 排除连续4个以上相同碱基(AAAA/TTTT/GGGG/CCCC)
l 排除CpG基序(避免免疫激活)
Step 4: RNA二级结构评估
l 预测工具:：RNAfold（Vienna RNA Package）
l 算法：最小自由能（MFE, Minimum Free Energy）
l 参数：Turner热力学模型，37°C生理条件
l 评估指标: 使用RNAplfold计算每个碱基与其他碱基互补配对的可能性
Step 5: 脱靶风险评估
评估方法: BLAST全基因组比对
功能注释分析: 对所有脱靶基因进行GO/KEGG富集分析，特别关注:
l 核糖体蛋白编码基因（提示潜在细胞毒性）
l 细胞周期调控基因（可能影响细胞增殖）
l 凋亡通路基因（可能导致非特异性细胞死亡）
Step 6: RNase H切割偏好性评分
l 评分依据：RNase H1酶对RNA-DNA杂交体的序列偏好性
l 算法：Position Weight Matrix(PWM) 基于大规模实验数据，RNase H1酶在不同序列背景下的切割效率存在显著差异。
Step 7: 跨物种序列保守性分析
l 评估靶点在不同物种间的保守性
l 支持临床前动物模型的研究设计
l 降低药物开发阶段的物种转换风险
珠海舒桐高通量测序实验室为您提供专业的ASO靶点设计与筛选服务，标准周期15-20个工作日，交付Top 10-15条优化序列及完整筛选报告。包括非人灵长类物种保守性分析、物种特异性ASO设计、化学修饰AI优化建议等，全方位满足您的研发需求。项目启动流程简单快捷，只需提供靶基因信息(Gene Symbol或序列)和研究目的，我们将完成初步可行性评估并提供详细报价方案。
下期预告:《ASO靶点筛选 | 从设计到验证的完整实验方案(下)》将详细介绍体外活性验证的标准流程，包括细胞系选择、转染优化、RT-qPCR检测、Western Blot蛋白验证等内容，敬请期待！
参考文献
[1] Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-694.
[2] Crooke ST, Witztum JL, Bennett CF, Baker BF. RNA-Targeted Therapeutics. Cell Metab. 2018;27(4):714-739.
[3] Dhuri K, et al. Antisense Oligonucleotides: An Emerging Area in Drug Discovery and Development. J Clin Med. 2020;9(6):2004.
