Nature Communications｜hpCasMINI：超紧凑CRISPR编辑器破解AAV容量限制

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Nature Communications｜hpCasMINI：超紧凑CRISPR编辑器破解AAV容量限制

舒桐科技

2025-12-05

导读：微型基因编辑器的革命性突破研究亮点核心创新：通过N端添加α-螺旋结构，将CasMINI（529 aa）改造为hpCasMINI（554 aa），显著提升基因编辑效率。

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微型基因编辑器的革命性突破

研究亮点

核心创新：

通过N端添加α-螺旋结构，将CasMINI（529 aa）改造为hpCasMINI（554 aa），显著提升基因编辑效率。

性能提升：

1）基因激活效率提高1.4-3.0倍，DNA切割活性提升1.1-19.5倍。

2）特异性指数达0.98，脱靶位点数量远低于SpCas9（平均1.3 vs. 95.1）。

技术普适性：

相同策略成功应用于hpOsCas12f1（458 aa）和hpAsCas12f1（447 aa），证实结构优化策略的广泛适用性。

Part.01

研究背景 | 基因治疗的递送瓶颈与小型化需求

传统CRISPR-Cas系统（如SpCas9、LbCas12a）分子量超过1000个氨基酸，难以包装进AAV病毒载体（容量约4.7-5.0 kb），限制其体内应用。小型Cas12f系统（如CasMINI、enOsCas12f1）虽体积小（350-529 aa），但编辑效率低。

本研究通过空间结构优化突破这一局限。

Part.02

技术突破 | α-螺旋添加策略的结构基础

研究团队通过对比高活性Cas12a与低活性Cas12f的结构，发现Cas12a的N端存在一个关键α-螺旋结构，而Cas12f缺失该结构。通过删除或替换LbCas12a的N端α-螺旋，其活性丧失，证实该结构的重要性。

图1．Cas12a与Cas12f的N端结构域对比显示关键差异

工程化设计：将外源α-螺旋（如Gp41S2）融合至CasMINI的N端，并优化连接肽（如刚性linker 2EAK），构建dhpCasMINI-VPR（用于基因激活）和hpCasMINI（用于DNA切割）。

AI辅助预测：利用AlphaFold预测enOsCas12f1和AsCas12f1的结构，指导类似改造。

Part.03

研究解读

核心发现｜效率与特异性的双重提升

（1）基因激活能力显著增强

在G5-mNeonGreen报告系统中，dhpCasMINI-VPR将mNeonGreen阳性细胞比例从36.7%提升至50.6%，内源基因（如HBG1、IL1RN）激活效率提高最高达6.7倍。

图2. hpCasMINI在多个基因组位点的编辑效率对比

（2）DNA切割效率与特异性平衡

· 效率提升：在10个基因组位点，hpCasMINI的indel频率从CasMINI的5.2%-10.2%提升至23.7%-75.2%（图2b）。

· 特异性优势：Tag-seq显示hpCasMINI的脱靶位点数量（平均1.3个）远低于SpCas9（95.1个），且对gRNA错配耐受性低（单错配即导致活性显著下降）。

图3.特异性分析显示hpCasMINI具有显著优于传统编辑器的安全特性

体内验证｜从小鼠模型到肿瘤构建

（1）体内基因激活

通过水动力尾静脉注射，dhpCasMINI-VPR在小鼠肝脏中激活荧光素酶报告基因和内源Fgf21基因，效率比dCasMINI-VPR提高3.9-4.7倍（图4b-e）。

图4. 体内实验证明dhpCasMINI-VPR在肝脏中的高效基因激活能力

（2）肿瘤模型构建

hpCasMINI通过靶向Trp53和Pten基因并插入KrasG12D，成功构建肝内胆管癌模型。hpCasMINI组小鼠肝脏肿瘤结节数量（平均5.3个）和肝脏重量（2.0g）均显著高于CasMINI组（1.8个，1.4g）（图5b-d）。

图5. hpCasMINI成功构建肝内胆管癌模型

比较优势｜hpCasMINI vs. 传统编辑器

· 基因激活：dhpCasMINI-VPR在HBG1和IL1RN位点的激活效率显著高于SpCas9和LbCas12a（图6b）。

· DNA切割：hpCasMINI在部分位点（如SITE1）效率媲美SpCas9，但特异性更高（特异性指数0.98 vs. SpCas9的0.16）（图6e-f）。

图6. 综合性能比较显示hpCasMINI在特异性方面的显著优势

普适性验证｜策略扩展至其他Cas12f系统

· hpOsCas12f1：编辑效率提升1.2-2.5倍，特异性不变（图7b-f）。

图7.hpOsCas12f1的成功开发证明策略的普适性

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