让合适的质粒匹配最适合的抗性，是实验成功的关键第一步。

质粒转化是基因克隆、蛋白表达等研究的核心步骤——将构建好的“基因蓝图”（质粒）导入细菌（如大肠杆菌），让这些微小的“细胞工厂”生产目标分子。而筛选出成功接收质粒的细菌，离不开抗生素抗性基因的帮助。质粒上携带特定的抗性基因（如氨苄青霉素抗性基因AmpR，卡那霉素抗性基因KanR）。当质粒成功导入细菌后，这些基因会表达相应蛋白，赋予细菌在含抗生素培养基上存活的能力。

· AmpR 表达β-内酰胺酶，水解氨苄青霉素，使药物失去破坏细菌细胞壁的能力。

· KanR 表达氨基糖苷类修饰酶，修饰卡那霉素，使药物无法抑制细菌核糖体功能。

未成功导入质粒的细菌，因缺乏这种“防护盾牌”，会在含抗生素的培养基上死亡。通过这种“生存考验”，就能筛选出成功转化的阳性菌落。

不同的质粒需要匹配不同的抗性，是由质粒特性和抗性基因特点共同决定的优化策略。

案例1

pSC101（低拷贝质粒）+ KanR → “稳定组合”pSC101是一种低拷贝质粒，每个细胞通常只有几个拷贝，常用于表达对拷贝数敏感的有毒基因，或需要构建稳定的工程菌株进行长期研究。

· 筛选严格稳定：KanR几乎不产生卫星菌落，筛选严格性极高。这对于需要长期培养或连续传代的实验至关重要，能确保只有真正携带质粒的细菌才能存活。

· 对低拷贝质粒更友好：这是最关键的一点。低拷贝质粒不建议使用AmpR，因为其Amp抗性基因表达量可能不足，导致转化菌生长缓慢甚至死亡。而KanR的作用机制对表达量要求较低，即使质粒拷贝数少，也能提供足够的抗性。

小结：pSC101的核心任务是“稳”，其低拷贝特性决定了它无法承受AmpR可能带来的表达量不足的风险，而KanR的严格性和稳定性恰好弥补了这一“弱点”。

案例2

pUC19（高拷贝质粒）+ AmpR → “效率组合”pUC19是一种经典的高拷贝质粒，每个细菌细胞内可存在数百个拷贝，主要用于快速克隆、高效扩增DNA。

· 抗性基因负担低：AmpR基因大小仅约800bp，对质粒复制负担极低，确保了pUC19的高拷贝特性不受影响。

· 筛选速度快：AmpR平板上菌落生长迅速（12-16小时即可形成清晰菌落），非常适合短期、快速的克隆筛选。

· 高拷贝数弥补缺陷：pUC19的高拷贝数确保了β-内酰胺酶的表达量充足，足以完全水解周围的氨苄青霉素。虽然AmpR有卫星菌落的风险，但在短期培养（<24小时）内可以规避。

小结：pUC19的核心任务是“多”和“快”，AmpR基因小、不拖累复制速度，且筛选迅速，完美匹配了这一需求。

选择氨苄青霉素抗性 (Amp) 的场景：

· 短期筛选实验 (1-2天)：仅需挑取单菌落、进行小量质粒提取时，AmpR生长速度快，可缩短周期。

· 构建重组载体或使用高拷贝质粒：AmpR基因片段小，不会增加质粒额外负担，不影响复制效率。

· 对筛选速度要求高：需要尽快拿到阳性菌落进行紧急验证时。

选择卡那霉素抗性 (Kan) 的场景：

· 长期培养或大量质粒提取 (3天以上)：KanR几乎不产生卫星菌落，能在长期培养中保持筛选严格性。

· 严格筛选场景：需要筛选“稳定携带质粒”的工程菌时，能更彻底地排除假阳性。

· 使用低拷贝质粒或敏感菌株：KanR对表达量要求较低，即使质粒拷贝数少，也能让细菌正常生长。

Q: 氨苄平板放久了出现卫星菌落，还能用于筛选吗？

A: 不能。卫星菌落会干扰判断，建议氨苄平板在倒好后48小时内使用，且培养时间不超过24小时。

Q: 低拷贝质粒能用氨苄抗性吗？

A: 不建议。低拷贝可能导致抗性基因表达量不足，转化菌无法存活或生长缓慢。

Q: 如果质粒同时携带Amp和Kan抗性，该选哪种？

A: 优先选择卡那霉素，因其筛选更严格，能减少假阳性；若需短期快速验证，也可选氨苄，但需控制培养时间。

除了Amp和Kan，实验室中还有其他常见的质粒系统和抗性选择：

· 氯霉素：其抗性基因（Cat）通过乙酰化使药物失活。氯霉素本身可抑制蛋白质合成，有时与Amp联用以增强筛选压力，防止质粒丢失。

· 壮观霉素：其抗性基因通过修饰核糖体来抵抗药物。壮观霉素非常稳定，且抗性基因较小，也是一种常用选择。

· 无抗性筛选：对于一些特殊应用（如基因治疗载体制备），会使用无抗性基因的筛选系统，如营养缺陷型互补或毒素基因反式互补等。