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在基因治疗生产体系中，载体 DNA 的纯度直接影响其体内表达效率与安全性。Minicircle DNA（MC）因去除了质粒骨架（PB）而具有更高的转基因表达能力、更低的免疫原性，被视为下一代非病毒基因载体。然而，在常规 MC 生产过程中，未重组的亲本质粒（PP）及 PB 的残留仍然是影响产品质量的核心限制因素[1]。
传统 MC 工艺在纯化阶段，即使经过柱层析等流程，PP/PB 杂质通常仍可达到 0.5%–1.5%，已超过 FDA 及 WHO 对某些类别转基因载体杂质水平的风险控制建议[1]。
为解决这一瓶颈，研究提出了利用三重螺旋 DNA（Triplex DNA，TriD）作为选择性捕获结构的策略，通过在质粒中引入特定序列，使 PP 与 PB 更易被识别、富集并去除[1]。研究显示：当 TriD 序列由 15 bp 延长至约 84 bp 时，对杂质的捕获能力显著增强；即便起始 PP 杂质含量高达 10%，纯化后的残留仍可降至 0.5% 以下[1]，并在不同质粒分子量范围（5.8–9 kb）内保持约 94%–95% 的 MC 回收率。
以上研究为工业级 MC 纯化工艺的升级提供了重要依据。
目前常用的 MC 生产技术虽然能够生成具备高表达能力的载体，但在去除杂质（PP、PB）方面仍存在问题。例如，传统 MC 质粒生产技术在效率、成本、可规模化生产方面都有瓶颈。特别是在生产流程中，即便经过纯化处理，MC 产品中仍可能含有达到 0.5%–1.5% 的杂质 DNA，已超出一些监管机构（如 Food and Drug Administration FDA 或 World Health Organization WHO）对转基因载体杂质水平的建议。
传统MC质粒生产方式示意图
为了突破上述瓶颈，研究团队提出了改进版的 TriD 技术。
其核心在于：在生产质粒（PP）设计中增加优化的三重螺旋形成序列，使其更容易与杂质 DNA（如 PB 或未重组 PP）形成三重螺旋结构
并借此实现更高效的捕获或去除。具体优化如下：
优化三重螺旋（TriD）形成序列长度
研究显示，将 TriD 形成序列从较短（如 15 bp）延长至 84 bp 后，MC 产品中杂质 DNA 的残留显著下降。
考察起始杂质比例对纯化效率的影响
研究中还加入了不同比例（如 1%–10%）的 PP 杂质到 MC 产品中，测试纯化前后杂质水平。
结果表明：即便起始杂质高达 10%，经过改进 TriD 纯化后，杂质水平也可降至低于 0.5%。
不同大小生产质粒（PP）对纯化效率的影响
另外还测试了不同分子量大小（例如 5.8 kb 到 9.0 kb）PP 对纯化结果的影响。
结果表明：不论 PP 大小变化，改进后的 TriD 技术均能将杂质含量控制在非常低水平，同时 MC 的回收率保持在较高水平（94%–95%）。
通过以上优化，研究团队成功将 MC 产品中的 PB 和 PP 杂质浓度降至 ~0.03% 以下，显著低于一般标准。
MC 的优势
无细菌骨架序列：MC 删除了质粒骨架 DNA（如抗生素抗性基因、复制起点等），从而减少了细菌来源序列导致的免疫反应风险。
体积更小、转染效率更高：由于去掉了不必要的骨架序列，MC 的体积更小，进入细胞和到达细胞核的效率更高，从而可提升转基因表达水平。
更长效的表达：研究表明，与传统质粒相比，MC 在细胞中可维持更长时间的表达。比如，用于 iPSC 重编程时，其表达效果明显优于普通质粒。
降低免疫原性：因为缺少细菌 DNA 元件，MC 对宿主免疫系统的刺激更低，适合用于体内基因治疗或疫苗应用。
更强的载体适配性：MC 可整合更大的疗法载荷（尤其是在不含抗性基因等骨架序列时），并且适配多种递送方式。
MC 的应用前景
基因治疗与基因编辑：MC 被认为是“下一代”非病毒基因载体，在 CRISPR/Cas 系统、基因替换、基因修复领域具有巨大潜力。
干细胞与 iPSC 制备：例如，研究使用 MC 载体来生成人类诱导多能干细胞（hiPSCs），避开病毒载体可能的插入突变风险。
DNA 疫苗与免疫治疗：MC 可用于携带抗原基因或免疫调节序列，因其表达高效且免疫刺激低，在疫苗开发方面展现潜力。
细胞治疗（如 CAR-T 细胞）：在 CART 制造过程中，使用 MC 载体可减少 DNA 毒性、提高转染效率，从而改善 T 细胞工程化流程。
病毒载体制造辅助：例如，在 AAV 病毒载体生产中，用 MC 替代传统质粒作为包装启动子或辅助质粒，可减少细菌元件污染，提高最终病毒制剂纯度。
面临的挑战
当然，MC 虽然优势显著，但仍面临一些挑战：
生产工艺复杂、纯化难度大
批次间一致性、规模化生产仍待完善
在临床中的长期安全性、稳定性还有待更多数据积累
通过改进的 TriD 技术，研究团队显著提升了 MC 产品的纯度，将杂质水平降至极低，实现了对 MC 载体质量的突破。而 MC 本身凭借其结构简化、载体体积减小、转染效率提升、免疫原性降低等优势，正成为 基因治疗、免疫治疗、干细胞工程与病毒载体制造等多个领域的重要载体选择。未来随着生产工艺的成熟与质量控制体系的完善，MC 有望迎来更广泛的临床应用。
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miniplasmid-pro-2：
基于 TriD 机制的升级版纯化平台
舒桐科技开发的 miniplasmid-pro-2 纯化技术，并非简单采用 TriD，而是在 TriD 机制基础上进行了结构优化、工艺放大与操作流程重构，使其更适应中试级、产业级 MC 生产的质量要求。
miniplasmid-pro-2 技术的核心改进包括：
TriD 功能序列的结构性增强
通过对 TriD 序列长度、排列方式及在质粒构型中的位置进行工程化优化，使 PP/PB 与 TriD 区域的结合能力更稳定，提高杂质富集效率。杂质捕获效率提升及动力学优化
针对研究中曾观察到的“起始杂质量较高时捕获效率下降”现象，miniplasmid-pro-2 对反应条件（包括离子强度、温度窗口、结构稳定剂等）进行了系统优化，使杂质量达 10% 的情况下仍能保持极低的残留水平。面向生产放大的流程重构
传统 TriD 方法在放大过程中存在步骤复杂、工艺窗口窄的问题。miniplasmid-pro-2 通过调整缓冲体系、连续化操作设计以及对关键步骤的标准化，使纯化效率在中试与产业化规模中保持稳定。
在提升纯度的同时保持高回收率
改良后的结构及流程使 MC 的整体回收率维持在较高水平，并使 PP/PB 杂质的最终残留可降至约 0.03% 级别，满足更高标准的载体开发需求。
适用场景与工艺价值
通过结构优化与可放大工艺设计，miniplasmid-pro-2 技术适用于以下高要求应用：
CRISPR 基因编辑载体
细胞治疗（如 CAR-T）
干细胞（hiPSC）重编程载体
DNA 疫苗
AAV 生产中的辅助质粒替代
对免疫原性敏感或需长期表达的体内给药场景
相比传统 MC 工艺，miniplasmid-pro-2 在稳定性、规模化能力、纯化性能及批次一致性上均具备明显优势
联系方式
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