一、原理概述
1.1 什么是圆二色谱（CD）
圆二色谱（Circular Dichroism, CD）是一种基于手性分子对左、右圆偏振光吸收差异的光谱技术。
当光波为圆偏振状态通过样品时，如果样品中存在手性结构（如蛋白质的螺旋结构、核酸的双螺旋等），它会对左圆偏振光（L）和右圆偏振光（R）的吸收不同，从而产生可测的信号。
其数学表达式为：
ΔA＝AL − AR＝(εL − εR)·c·l
其中：
AL、AR 分别为左、右圆偏振光的吸收；
εL、εR 为对应摩尔消光系数；
c 为样品浓度；
l 为光程长度。
在多数生物大分子研究中，CD 信号常用平均摩尔椭圆度（molar ellipticity，[θ]）表示，与 Δε 的关系为：
[θ]＝3298 × Δε
1.2 仪器与测量波段
典型 CD 光谱仪包括：
光源（氙灯）、单色器、偏振调制器（产生交替的左、右圆偏振光）、样品池室与检测器。仪器交替测量两种偏振态下的透过光差异，得到 CD 光谱。
结构示意图
按波长区分常见的三种测量区段：
远紫外 CD（Far-UV, 170–250 nm）：反映蛋白质主链结构，用于分析二级结构比例（α-螺旋、β-折叠、无规卷曲等）。
近紫外 CD（Near-UV, 250–320 nm）：揭示芳香族氨基酸或辅基环境信息，与三级结构相关。
可见 CD（Visible CD）：用于金属蛋白、染料或配体结合体系的构象研究。
1.3 原理要点
CD 信号来源于手性分子对左右圆偏振光吸收差异（ΔA）。
CD 信号极小，因此样品吸光度过高会掩盖真实信号。
理想情况下，样品在测定波段的吸光度应控制在 0.6–1.0 OD 以内，以保持信噪比。
CD 光谱常用于研究蛋白折叠、构象变化、二级结构比例、配体结合及热稳定性等。
二、样品准备
2.1 样品浓度与类型
CD 常用于分析蛋白质、肽、核酸及其他手性小分子。
浓度需与光程匹配：
若光程为 0.1 cm（1 mm），蛋白浓度一般在 0.1–1 mg/mL 范围较合适；
吸光度过高会导致噪声上升，过低则信号微弱。
建议通过紫外 280 nm 吸光度或 BCA 法测定浓度。
2.2 缓冲体系与溶剂
远紫外 CD 对溶剂吸收非常敏感，应避免使用高吸收组分。
推荐使用低吸收缓冲液（如 10 mM PBS、NaF、Tris 等），避免含有高浓度盐或强吸收成分（如 Cl⁻、DTT、甘油等）。
若测量至 190 nm 以下，可使用更短光程池（0.05 cm）或更换为 D₂O 溶剂以减少吸收。
对膜蛋白样品，需评估去垢剂或脂质的背景吸收。
2.3 光程池与测量条件
常用石英池，光程 0.1 cm 或 0.2 cm。
远 UV 测量宜用短光程（0.05–0.1 cm），减少吸光影响。
池体需干净无划痕、无气泡，测前应以缓冲液清洗。
温控可使用 Peltier 装置，以实现热变性或温度扫描实验。
2.4 样品准备要点
样品应澄清透明，避免沉淀或悬浮颗粒。
测前可进行透射检查，确认目标波长处透光良好。
各条件（浓度、缓冲、温度）尽量保持一致，以便比较。
三、数据测定与处理
3.1 测定规划
根据实验目的确定扫描范围、步长与温度控制。例如：
二级结构分析：190–260 nm；
热变性实验：监测 222 nm 随温度变化；
配体结合实验：比较配体加入前后的光谱形状。
3.2 数据采集
扫描缓冲液背景，记录空白谱。
测样本谱，确保无气泡、无漂移。
多次扫描取平均值以提高信噪比。
记录 HT 值（高压电压）或透光率，避免超限区段。
3.3 背景校正与单位换算
用样本谱减去空白谱，即为纯 CD 信号。
随后将观测椭圆度（θobs）换算为平均摩尔椭圆度：
[θ]＝(θobs × 100 × M) ÷ (c × l)
其中：
θobs 为观测椭圆度（mdeg）；
M 为分子量（g/mol）；
c 为样品浓度（g/L）；
l 为光程（cm）。
建议报告单位为 deg·cm²·dmol⁻¹，以便与文献数据比较。
3.4 二级结构分析
典型蛋白质 CD 光谱特征如下：
α-螺旋：208 nm 与 222 nm 处负峰；
β-折叠：约 217 nm 负峰；
无规卷曲：195–200 nm 负峰。
可使用软件（如 CAPITO、CDtoolX）拟合 α-螺旋、β-折叠及无规卷曲比例。
比较不同条件（pH、配体、突变体）下光谱形状，即可判断构象变化。
α-螺旋，β-折叠
3.5 热变性与稳定性分析
监测单一波长（如 222 nm）随温度变化，可绘制热变性曲线。
曲线呈“S”型时，中点温度即为蛋白折叠-展开转变温度（Tm）。
若样品在高温下聚集或浑浊，应重复实验验证可逆性。
3.6 结果展示与报告
在报告或公众号中常用两类图示：
CD 光谱图：椭圆度 vs 波长曲线，标出 α-螺旋、β-折叠峰位。
热变性曲线：温度 vs 椭圆度，标注 Tm。
报告建议包含：样品浓度、光程、缓冲体系、测量温度与重复次数，以增强结果可比性。
四、常见误区与建议
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五、应用场景举例
蛋白折叠判断：纯化后检测是否形成 α-螺旋结构。
突变体比较：分析结构差异或稳定性变化。
配体结合分析：观察结合引起的结构重排。
热稳定性研究：确定蛋白 Tm 值。
核酸构象分析：区分单链与双螺旋状态。
药物质量控制：评估生物制剂的高阶结构一致性。
不同样品的对比
六、小结
圆二色谱是一种灵敏且非破坏性的结构分析手段。
通过合理的样品准备、参数设置与数据处理，可快速获得蛋白或核酸的二级结构信息、构象变化及热稳定性。
在科研、药物开发与结构生物学中，CD 光谱法都是一项重要的基础工具。