我很喜欢华裔科幻作家姜峯楠（Ted Chiang）的短篇小说《你一生的故事》，以及由此改编的电影《降临》：语言的结构与时间的流动密切交织，作品里的主角通过学习外星人七肢桶的语言，逐渐改变了自己对时间和生命的理解。语言不再是单向流动的工具，而是一个多维度的存在，能够打破线性时间的束缚，让个体在过去、现在和未来之间自由穿梭。当我们理解和掌握了一种新的 “语言”，我们就进入到了一种新的“世界”。
而如今生物学家和神经科学家对蚂蚁群体行为和蚂蚁大脑“分子水平”结构的研究，让我们看到了未来的希望——我们是否有可能真正理解人类自己的社会性，以及我们那些超越社会性的东西是如何运作的，还有掌握一门“跨物种的语言”是什么感觉。
蚂蚁并没有类似人类的语言系统，却能通过简单的化学信息传递、触觉反馈和行为模式，构建出一个高度复杂的群体行为社会体系。在这种“群体语言”中，信息的流动也并不是以个体的“线性时间”进行，而是通过集体的互动和合作，在一个多维的空间中迅速地实现目标。这可能也是未来能赋予人工智能和集体智慧的启发。
这篇文章最让我们触动的地方，莫过于一位年轻女性科学家如何在面对导师们都不看好的情况下，凭借自己的坚定信念和孜孜不倦的努力，最终推动了科学的前沿，迈出了那至关重要的一小步。对未知世界探索的好奇心的力量是无限的。希望你会喜欢这篇文章。
—— Asimov Press 中国团队
亚里士多德将人类定义为最高等的“社会性动物”（social animal）。然而纵观进化历程，社会性行为在生物界多次出现，像蚂蚁、白蚁以及许多蜜蜂和黄蜂这样的“真社会性”（eusocial）昆虫，或许才是社会性的典范。
蚂蚁，也就是我研究的对象，已经以紧密且高度协作的家族群体形式生活了超过一亿年。它们发展出了精密的沟通方式，能够协调数千个个体间的活动，而无需依赖中央化的等级体系（a centralized hierarchy）。
与人类使用口语和书面语不同，蚂蚁和其它社会性昆虫通过释放信息素（pheromones）进行交流。这些化学信号分子能触发不同行为并分配任务。蚂蚁的化学信号种类繁多，包括用于群体觅食的招募信息素（recruitment pheromones）和用于防御威胁的警报信息素（alarm pheromones）。
随着时间推移，蚂蚁的社会互动和生存策略愈发复杂，其大脑中与嗅觉和信息素解读相关的区域显著扩展。这种高度发达的嗅觉系统（olfactory system）不仅帮助我们理解蚂蚁的行为，还可能为神经科学家提供宝贵线索，探索包括人类在内的高级物种的沟通演化。
然而，研究蚂蚁及其大脑并非易事。近年来，神经生物学研究由于活体神经活动记录技术（record neural activity from living organisms）的进步取得了很大突破。这种技术通常通过将一种新的 DNA 片段（称为转基因，transgene）引入生物体，使其在动物大脑中表达来实现。比如，如果该转基因编码一种名为 GCaMP 的钙离子感受器蛋白，当神经元活动时会发出荧光绿光，我们便能直接记录生物体在面对新刺激（如气味或味道）时的大脑活动。然而，这种技术在蚂蚁中从未成功过，直到最近。
在洛克菲勒大学（Rockefeller University）攻读博士学位期间，我参与了制造世界上首批转基因蚂蚁的项目。我们的研究成果于 2023 年发表于《细胞》（Cell）杂志，历经七年精确而艰苦的工作。这些转基因蚂蚁在其神经元中表达 GCaMP，使我们能够直接观察和记录蚂蚁在检测信息素和气味时的大脑活动。我们的研究还揭示了蚂蚁大脑中一个关键区域，我们认为这个区域使它们能够识别警报信息素并启动集体防御反应。
以下是我们如何改造这些蚂蚁的故事。
在我开始博士研究时，针对蚂蚁及其他社会性昆虫的神经科学研究几乎停滞不前。最初吸引我研究这些动物的复杂社会组织，恰恰成为了实验工作的最大挑战。
大多数社会性昆虫的蚁后在离开自然环境后就不会交配或建立新群落。实验室环境很难模拟这些条件，因此培养转基因蚂蚁似乎遥不可及。
然而，就在我开始博士研究时，科学家们在蚂蚁基因编辑领域迎来了重大突破。我的导师 Daniel Kronauer 领导的团队，以及纽约大学的另一组研究人员，同时报告了首批通过 CRISPR 技术编辑基因的蚂蚁。这两组团队巧妙地利用了一些具有特殊生殖策略的蚂蚁种类，克服了蚂蚁社会性复杂带来的实验难题。
图片来自洛克菲勒大学：丹尼尔·克罗诺尔（Daniel Kronauer）曾在委内瑞拉的高海拔云雾森林中追踪军蚁，拍摄它们的露营巢穴——这些巢穴完全由生活在其中的蚁群成员构成。因为人类和蚂蚁共享古老的机制，这一模型系统可能反过来揭示人类生物化学与社会行为之间的联系。
在过往的研究课题当中，Kronauer 的研究小组对蚂蚁进行了长达 45 天的观察，以确定群体大小是否会影响蚁群的行为和稳定性。
Kronauer 实验室（The Kronauer Lab）聚焦于一种独特的蚂蚁种类——克隆掠夺蚁（clonal raider ant）。这种蚂蚁可以在没有蚁后的情况下繁殖，并且具有孤雌生殖的能力（parthenogenetic），即无需交配即可繁育后代。克隆掠夺蚁易于在实验室中饲养，非常适合基因编辑实验。
为了培育这些突变体蚂蚁（mutant ants），研究人员收集了数千个蚁卵，用锋利的玻璃针小心刺入，并向每一颗卵子注射含有 CRISPR DNA 切割酶的诱变溶液（mutagenic solution containing a CRISPR DNA-cutting enzyme）。CRISPR 基因编辑的工作原理如同一把剪刀，可在特定位置切割 DNA，细胞随后修补这一损伤，但修补过程中会积累小错误，导致基因功能的改变。然而，在蚂蚁中，这一技术效率极低：超过 3000 个注射的蚁卵中，仅 42 个发育至成虫，最终仅产生 7 种突变体，成功率不足 1%。相比之下，在其它昆虫如果蝇（vinegar fly）中，CRISPR 基因编辑的成功率可高出 35 倍。这些蚂蚁虽然是突变体（mutants），却不是转基因（transgenic）蚂蚁，因为它们的基因组中没有插入外源 DNA。
一张照片显示一只表达 GCaMP 的转基因蚂蚁蛹（右）及一只野生型蚂蚁蛹（左）。该图像为白光摄影与荧光摄影的合成，以便显示荧光蛋白。图片来源：Taylor Hart
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作为一名初出茅庐的博士生，我希望能跨越一步，直接制造转基因蚂蚁，将编码 GCaMP 的转基因插入蚂蚁基因组，使其能够在神经元中表达，并为我们提供关于大脑内部活动的反馈。
实现这一目标有两种主要方法。一种是向蚁卵注射CRISPR切割酶（CRISPR cutting enzyme），同时加入一段“插入”DNA（"insert" DNA）。在基因组切割处，这段插入 DNA 可能填补空隙，从而生成携带新基因的生物，这种新基因可以传递给下一代。但这种方法的效率比单纯使用 CRISPR 酶切割基因低约十倍，因为插入 DNA 必须在细胞修复损伤前快速填入。按照这一方法，我可能需要注射约一万颗蚁卵，才能获得少量用于实验的转基因幸存者，理论成功率可能仅为0.1%。(在我博士生涯即将结束时，我的论文委员会透露，他们最初对我能否成功持怀疑态度。)
幸运的是，我了解到还有另一种制造转基因蚂蚁的方法，那就是使用转座酶（transposase）。
在发现 CRISPR 之前，分子生物学家就已经知道转座子（transposons）(又称"跳跃基因"，jumping genes)的存在。转座子是一种能够从基因组的一个部分跳跃到另一个部分的 DNA 序列。每个转座子都会编码一种蛋白质，这种蛋白质能够识别特定的 DNA 片段，通常是转座子本身的一部分，然后以一种伪随机的方式（a pseudo-random manner）将这一序列插入到其它地方。这种过程可以被形象地比喻为 DNA 的“复制粘贴”（CTRL-C + CTRL-V）。
一种名为 piggyBac 的转座子系统曾被“借用”（hijacked）来将转基因 DNA 导入蜜蜂基因组中，而蜜蜂是蚂蚁的另一个群体社会性亲缘物种（another eusocial relative of the ants）。研究人员通过向蜜蜂卵注射两种成分实现了这一壮举：携带 piggyBac 识别序列的插入片段和能够物理“剪切”和“粘贴”该 DNA 到基因组中的转座酶。
当这两种成分被注射到细胞中时，转座酶会附着到识别序列上，将 DNA 插入细胞的基因组中。随后，转座酶会被细胞降解，而插入的 DNA 片段则稳定留在插入位置。此过程在注射蜜蜂卵时表现出了高效性，最终生成携带插入 DNA 的蜜蜂成虫。鉴于转座酶在蜜蜂中的成功应用，以及 CRISPR 在蚂蚁中极低的成功率，我们决定采用转座酶系统，认为这是制造转基因蚂蚁的最佳选择。
然而，在注射蚂蚁卵之前，我们需要精心设计并构建 DNA 插入片段，以转座子识别序列（transposon recognition sequences）为基础。我们希望 DNA 插入片段能够编码一种基因，当整合到蚂蚁基因组中时，会产生一种可以用显微镜观察到的可见信号。这样，我们可以轻松检查注射是否真的生成了转基因昆虫。
我们最初计划插入编码绿色荧光蛋白的 DNA，这种蛋白在紫外光下会使转基因昆虫发出荧光。然而，最常用的启动子（promoters）——使基因“开启”和表达所需的短 DNA 片段——通常只在昆虫的眼部活跃。（注1）换句话说，携带荧光蛋白的转基因蚂蚁只会有发光的眼睛，而其它部位不会发光。然而，这再次带来了问题：我们的研究物种——克隆掠夺蚁——是地下生物，没有眼睛。因此，我们需要找到一种能够在它们实际拥有的其它身体组织中表达荧光蛋白的启动子。
最终，我们找到了一种来自病毒的启动子，它此前已被用于在果蝇和飞蛾的许多身体组织中表达荧光蛋白。我们将该启动子与编码红色荧光蛋白的基因结合，这样就可以轻松识别我们的转基因蚂蚁，就像它们天生带着一个被喷涂的红色标记一样。
一个 DNA 插入片段可以容纳不止一个基因，因此我们还决定加入编码 GCaMP 的转基因。与任何基因一样，GCaMP 需要一个启动子来指定在哪些细胞中表达它。由于我们对蚂蚁通过信息素彼此交流的方式深感兴趣，我设计了一个能够在允许蚂蚁嗅闻物体的嗅觉神经元中表达 GCaMP 的构建，这一启动子来源于一个重要的嗅觉受体基因（odorant sensing gene），称为Orco。我们担心 GCaMP 的表达水平可能过低，无法检测到神经活动，因此还添加了一种额外的遗传元件 QF2/QUAS，用作基因的放大器（an amplifier for genes）。
如果一切按计划进行，我们的转基因蚂蚁将在身体的某些部位表达红色荧光蛋白，并在其大脑的感觉处理中心表达 GCaMP，这是一种在神经元激发时发出荧光的钙传感器（calcium sensor）。理想情况下，这些表达会与神经元的激发同步发光，使我们能够首次在历史上记录蚂蚁所有嗅觉神经元的脑活动。
一只表达 GCaMP 的转基因蚂蚁蛹（位于一组野生型蛹之间）。这些图像是白光摄影与荧光摄影的合成，以便显示荧光蛋白。左图使用了适合观察 GCaMP 的滤光组，右图使用了适合观察红色荧光蛋白的滤光组。两张图片展示的是同一批蚂蚁个体。图片来源：Taylor Hart
在组装好基因载体（genetic cargo）后，就到了制造突变体的阶段。我大量参考了克隆突袭蚁的卵注射方法，这种方法是 Kronauer 实验室用于制造 CRISPR 蚂蚁的基础技术。基本步骤没有改变：先组装转化混合物（transformation mix）（用转座酶和 DNA 插入序列代替 CRISPR 组分），然后将其装入一个细尖的玻璃针中。使用微操控装置控制针头的三维位置，通过调节旋钮精准定位针头，再连接压力供给装置，用鼠标点击来控制注射液体。显微镜下观察针尖和注射区域，用针尖轻敲玻璃以打开一个微小的注射孔。最后，收集新产下的蚂蚁卵，把它们排放在胶带上，并向每个卵注入少量转化混合物。
我和其他几位研究人员合作，系统地筛选了几十个小型蚂蚁群落，以找到最新鲜的蚂蚁卵。我们每周进行 3 天，每天注射 3-4 次，每次注射数百枚蚂蚁卵。
几个月过去了，得到的只有死亡的卵。这种挫败感难以言表，但除非我放弃实验和学位，否则我只能一遍又一遍重复这个过程。通过尝试不同的注射方法，我发现是注射过多液体导致卵死亡。不过，有时还是会有少量注射的卵孵化成了微小的幼虫。我逐渐学会了通过显微镜观察注射过程中卵黄形成的波纹，判断注射液体的适量。我还发现，当转座酶浓度过高时，混合物会变得有毒。
在调整配方后重新注射，我开始看到一些小范围区域出现红色荧光，而对照组中仅注射水的幼虫则没有。尽管结果令人鼓舞，但要使荧光图案变得一致和确凿（consistent and irrefutable），还需要几个月的时间。
在博士研究的 18 个月后，我掌握了蚂蚁卵注射技术，学会了提高幼虫的存活率，并注射了超过 4600 枚蚂蚁卵。一些蚂蚁存活下来，通过显微镜观察，我清楚地看到它们的身体发出红色荧光，而 GCaMP 蛋白在其触角和头部的感觉神经元中表达。这些蚂蚁正是我所希望的结果。
它成功了。
在理想条件下，每只克隆突袭蚁每周能产下少量卵。经过数月勤勉的蚂蚁饲养工作，我以这种方式收集了数十只，最终达到数百只蚂蚁。时不时地，我会看到带有红色荧光蛋白发光的蚂蚁后代，这证明插入的基因具有遗传性且稳定。但许多后代在几天后死亡，这可能是因为转座酶将转基因插入了基因组的关键位点，从而破坏了蚂蚁生存所需的重要基因。
最终，我从一只单一的转基因始祖蚂蚁（single transgenic founder）那里获得了数百只后代，这是一组经过良好控制的实验对象，它们的荧光模式明亮且高度一致。（注2）GCaMP 蛋白在大约 99% 的触角叶脑区（antennal lobe brain region）中表达，这一区域负责处理嗅觉信息。
制造转基因蚂蚁是漫长而艰苦的过程，但这仅仅是神经科学实验的前奏。在与实验室同事的一系列合作中，我们尽可能多地研究了这些突变蚂蚁。重要的是，当转基因蚂蚁闻到警报信息素后，它们的行为与野生型蚂蚁相似，表现出逃离巢穴的应激反应，这表明插入的基因并未破坏它们的嗅觉——这是我们研究的核心目标。
同时，我学会了通过显微镜记录蚂蚁大脑的神经活动。实验时，我将蚂蚁固定，用盐水和糖水覆盖其头部顶端，并在外骨骼上开一个小孔以露出大脑。盐水和糖水会流入大脑并防止其快速干燥。实验结束后，大脑活动被记录下来，而蚂蚁会被安乐死。
一只蚁蛹在其感觉神经元中表达 GCaMP。许多被注射的蚂蚁卵并未携带转基因。制造转基因蚂蚁耗费了七年的时间。图片来源：Taylor Hart
实验期间需格外小心，必须格外小心避免损坏脆弱的触角或大脑，因为大脑横截面不到半毫米。这种程序的标准方法已经为果蝇等更常见的研究物种开发出来，但并不适用于克隆突袭蚁（注3），因此需要大量尝试与改进。最终，我达到了能够可靠地用香味气流刺激蚂蚁，并通过显微镜观察其大脑某些区域如何对特定信息素产生强烈反应。
在博士项目的最后阶段，我进行了一个主要的神经科学研究，聚焦蚂蚁感知威胁的能力。这个项目涉及绘制蚂蚁大脑对警报信息素（相对于其它非信息素气味）作出反应的部位图谱。
研究发现，克隆突袭蚁的主要嗅觉处理脑区包含 500 多个亚区（subcompartments）（或称“神经纤维球”，glomeruli），其中只有六个对警报化合物有反应。这表明蚂蚁大脑在处理这一类信息素时具有高度专业化的神经结构。
我们还发现了一个可靠地响应三种不同警报信息素的脑区（a brain subcompartment ），表明该区域在启动蚂蚁防御行为中发挥了重要作用。
这些发现本身极具启发性（revelatory），但更令人惊叹的是，它们展示了我们在理解社会性昆虫交流方面取得的进展。
超越我们自身的社会性，正是人类通过语言进行交流的能力，使得亚里士多德将我们置于社会物种的巅峰。即使在几个世纪后的今天，生物学家仍未在非人类世界中发现可与人类语言相媲美的成就。然而，我们的耳朵并不适应倾听其他物种的“语言”，而且我们评估的也并不总是“语言”（our ears are not attuned to the “speech” of other species, nor is it always “speech” we are evaluating）。只有通过密集的实证研究，我们才能逐渐解读昆虫交流中涉及的各种要素和感知模式（various aspects and sensory modalities）。
在 20 世纪 40 年代至 70 年代期间，动物行为学家卡尔·冯·弗里施（Karl von Frisch）及其同事研究了蜜蜂如何向群体其它成员传递食物储藏点和新巢址的位置。冯·弗里施的实验优雅且精心设计，但它们只能记录外部的交流行为，而无法揭示蜜蜂大脑中实际发生的事情。与蚂蚁类似，蜜蜂的许多交流通过信息素进行，因此对肉眼来说是不可见的。（注4）冯·弗里施能够观察到的是蜜蜂的外部动作，这引导他发现了著名的“摇摆舞”（waggle dance）。
转基因技术和显微镜正在改变我们对外部行为代理（external behavioral proxies）的依赖。我们现在能够观察到，当一只蚂蚁感知到其社会伙伴用来交流的信息素信号时，其神经元如何因此而亮起。尽管我们仍需深入了解这种化学性的信息素“语言”（this chemical, pheromonal “language”）的细微差别，但我们新获得的蚂蚁大脑研究途径无疑将帮助我们更好地理解昆虫交流的复杂程度究竟可以达到什么地步。
注释：
1. 这是一个有意的选择：通常，通过眼组织观察荧光比通过被外骨骼覆盖的身体部位更容易。
2. 作为蚂蚁转基因项目的后续成果，我在接下来的一年中又生成了总计四条额外的转基因品系。（在其中一个案例中，我复制了这里描述的同一种转基因蚂蚁，但这次仅用了 353 次注射，而不是数千次！）凭借我积累的经验，制造这些新品系每个仅需几周的注射工作，与首次相比，感觉轻松了许多。
3. 这些方法在过去 20 年的众多研究中被广泛使用，并极大地促进了我们对果蝇嗅觉机制的详细理解。点击这里（www.jove.com/v/2976/calcium-imaging-odor-evoked-responses-drosophila-antennal）查看关于如何进行果蝇大脑嗅觉反应的钙成像实验的概述视频。
4. 去年也有报告首次成功创建表达 GCaMP 的转基因蜜蜂。
引用：
Taylor Hart. "Making the First Transgenic Ants." Asimov Press (2024). DOI: https://doi.org/10.62211/762hd-9tp3
原文发表于 2024 年 2 月 5 日。中文版由 Asimov Press 中国团队骄傲呈现。❤️
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