文锦坤团队 | 内含肽介导的Split-Cre系统的构建

Cre重组酶(cyclization recombination enzyme)即环化重组酶，是来源于噬菌体P1的一种蛋白酶，分子量约为38 kDa，它可以识别并催化2个LoxP位点之间发生同源重组。Cre-LoxP系统可以实现包括删除、插入、倒位及异位等多种类型的基因编辑^[1]。在基础研究领域，Cre-LoxP系统主要被应用于动物的基因编辑，可以作为高效的条件性基因打靶工具，同时在建立诱导型基因敲除小鼠模型的过程中也得到广泛的应用^[2-3]。此外，Cre-LoxP系统在标记激活基因和神经环路示踪等方面也有非常广泛的应用。近年来，研究人员把Cre酶进行拆分(Split-Cre)，即将Cre一分为二后分别导入动物体内，用于小鼠体内的多基因操控、多基因激活细胞标记以及远距离神经环路示踪等^[4-7]。Split-Cre技术的核心是利用拆分后的Cre酶在一定条件下在生物体内重组形成具有酶活性的全长Cre，进而通过LoxP位点对基因进行修饰。

内含肽(intein)是存在于前体蛋白质内部的一段多肽序列，是蛋白质水平上的真核生物基因内含子。它通过催化蛋白质自剪接反应将自身序列从前体蛋白质中剪切出来，并将其两侧的蛋白质序列以肽键进行连接^[8]。断裂内含肽(Split-intein)由被分裂成N端(IntN)和C端(IntC)的2部分肽段组成。单独的断裂内含肽IntN或IntC不具有蛋白质自剪接功能，但是N端前体蛋白质中的IntN与C端前体蛋白质中的IntC可互相识别并以肽键结合，形成有功能的完整内含肽^[9-10]。尽管以往也有许多研究将Cre基因进行拆分，例如通过亮氨酸拉链法^[4]等其他方法使其在表达后于细胞内重组，但Split-intein介导法由于其合成简便、剪接效率高且自剪切后不残留氨基酸序列等优势而被更加广泛地使用^[11]。

在目前的技术应用中，对Cre酶蛋白进行拆分的具体位点并没有统一的标准，也尚未见针对不同拆分位点的Split-Cre技术应用效果的分析研究。由于拆分后蛋白质分子结构的差异，在不同位点处进行拆分的Split-Cre系统的重组效率和作用效果也可能存在较大的区别。这种因素可能成为Split-Cre技术作为实验工具的一个潜在干扰变量，对实验结果造成严重的影响，甚至使Split-Cre技术不能发挥作用。

为了开发更高效的Split-Cre系统，本研究利用来源于海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus, Rma)的内含肽对Cre的T87、S102、S108和S110位点进行拆分，并在“红绿灯”报告细胞系中筛选能够高效介导Cre酶重组的S102拆分位点，进一步通过双腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)将S102 Split-Cre系统递送至小鼠体内，以期证明Rma内含肽介导的S102 Split-Cre系统在小鼠体内同样具有高效的活性。

2.1  内含肽介导的Split-Cre双质粒系统的设计

为了探究用Split-intein拆分后的Split-Cre的重组效率，本研究将Cre重组酶拆分为2个片段，即CreN和CreC，并分别在CreN的C端和CreC的N端上连接了海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus, Rma)的DnaB内含肽，该内含肽N端(IntN)和C端(IntC)分别包含  106个和51个氨基酸。其介导蛋白进行反式剪接的规律是IntC连接的C端蛋白质序列的首位必须是含有巯基或羟基的氨基酸，例如半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)。将Cre的编码序列拆分后，分别将IntN与CreN、IntC与CreC进行融合，然后将两个融合片段分别克隆至能够在真核生物细胞体内表达的pAAV质粒系统中。如图1A所示，将分别表达CreN-IntN和IntC-CreC的质粒同时导入细胞内，2种表达产物中的内含肽会进行反式剪接将CreN和CreC重组成具有酶活性的全长Cre。本研究根据Cre编码序列中段的氨基酸序列特点，选择了T87、S102、S108和S110这4个位点作为筛选断裂位点，选择Q90谷氨酸位点作为阴性对照位点(图1B)。

图1  Split-intein介导的Split-Cre双质粒系统的设计

Figure 1  Design of the Split-intein-mediated Split-Cre system. A: Schematic drawing of the structure of Split-intein-mediated Split-Cre system plasmids; B: Candidate split sites of Cre coding sequence.

2.2  “红绿灯”报告细胞系的构建

为了探究Cre基因的不同拆分位点在体外细胞实验的重组效率，本研究采用293T细胞构建了荧光表达报告细胞系。将“红绿灯”荧光元件LoxP-DsRed-Stop-LoxP-GFP克隆至慢病毒载体中，然后包装慢病毒并对293T细胞进行侵染，侵染后添加嘌呤霉素筛选以建立稳定表达该元件的细胞系(图2A)。报告细胞系在正常培养条件下表达DsRed红色荧光，GFP绿色荧光因为其上游存在Stop密码子而不能表达。当有功能的Cre结合至DsRed-Stop两端的LoxP位点时，将从基因组中切除LoxP-DsRed-Stop序列，从而使细胞不表达DsRed；同时，因为Stop密码子也一并被切除，下游的GFP可以启动表达，从而实现从红色荧光转变为绿色荧光的过程。接着将表达全长Cre的质粒通过PEI转染导入报告细胞系中，结果显示转染后48 h阴性对照组细胞只表达DsRed而不表达GFP，而转染全长Cre质粒组中的细胞表达明显的GFP。转染Cre组的细胞因为本底DsRed蛋白的存在，表现为GFP和DsRed双阳性细胞(图2B黄色箭头)；而部分细胞内的DsRed蛋白降解完全，则表现为GFP阳性而DsRed阴性(图2B白色箭头)；同时，由于少数细胞未能转染成功而呈现DsRed阳性而GFP阴性结果(图2B星号)。上述结果表明本研究成功构建了能够通过荧光变化提示Cre酶功能的“红绿灯”报告细胞系。

图2  “红绿灯”报告细胞系的构建

Figure 2  Construction of “Traffic Light” reporter cell line. A: The structure of LoxP-DsRed-Stop- LoxP-GFP traffic lights reporter system; B: After transfection of full-length Cre coding sequence, reporter cells showed potent GFP signal. Yellow arrows indicate the GFP⁺ and DsRed⁺ cells, white arrows indicate the GFP⁺ and DsRed⁻ cells, and asterisks indicate GFP⁻ and DsRed⁺ cells.

2.3  体外实验比较不同拆分位点的Split-Cre重组效率

“红绿灯”报告细胞系构建成功后，将Split-Cre双质粒系统转染至该细胞系中，48 h后观察细胞荧光表达，结果显示转染全长Cre的阳性对照组细胞表达明显的GFP，而作为阴性对照的Q90拆分位点组中的细胞无GFP信号；在4个候选位点中，S102组的细胞GFP表达最强，S108和S110组中也有明显的GFP阳性细胞，而T87位点几乎无GFP阳性信号(图3)。为了更准确地对Split-Cre的重组效率进行统计，使用流式细胞术对DsRed与GFP荧光信号进行检测。结果显示，S102位点组中的GFP阳性细胞百分比与全长Cre组比较无显著性差异，证明Rma内含肽介导的S102 Split-Cre系统在体外培养细胞内的酶活性与全长Cre相当。尽管向293T细胞内导入有功能的Cre酶后细胞将由DsRed阳性转变为GFP阳性，但是因为原先存在于细胞内的红色荧光蛋白需要一定时间降解，所以绝大部分细胞都呈现DsRed和GFP双阳性。GFP阳性与DsRed阴性的细胞是指DsRed蛋白已经完全降解的GFP阳性细胞，统计分析发现S102拆分位点组该部分细胞比例与全长Cre组比较无显著性差异，进一步证明Rma内含肽介导的S102 Split-Cre体外重组效率和全长Cre相当(图4)。

图3  不同拆分位点Split-Cre体外重组效率荧光检测实验

Figure 3  In vitro fluorescence detection of Split-Cre recombination efficiency of different sites. Full-length Cre serves as positive control, while Q90 serves as negative control.

图4  流式细胞术检测不同拆分位点的Split-Cre重组效率

Figure 4  FACS detection of Split-Cre recombination efficiency of different sites. A: Representative results of FACS detection; B: Statistical graph of percentage of GFP positive cells; C: Statistical graph of percentage of GFP positive and DsRed negative cells. NS: No significance.

2.4  小鼠体内实验验证S102 Split-Cre的重组活性

为了进一步检测Rma内含肽介导的S102 Split-Cre系统在动物体内的效率，用该系统的2种质粒包装AAV，通过双AAV将S102 Split-Cre系统通过尾静脉注射的方式递送至R26-CAG- LSL-tdTomato转基因报告小鼠体内。该转基因小鼠基因组的Rosa26位点被插入了由CAG启动子启动表达的LoxP-Stop-LoxP-tdTomato序列，在正常生长发育过程中该小鼠体内不表达tdTomato蛋白。而当其体内导入Cre酶后，Cre酶通过LoxP位点将Stop元件切除后即可启动tdTomato表达(图5A)。因为小鼠肝组织的取材和冰冻切片较易操作，所以本研究选择肝脏作为体内验证实验的靶器官，并选择了对肝脏具有亲嗜性的AAV8。将表达S102 Split-Cre的AAV注射至小鼠体内1周后，将小鼠肝脏取出并进行冰冻切片以观察tdTomato的表达情况，结果发现S102 Split-Cre组小鼠肝脏表达广泛且明显的tdTomato红色荧光，其介导tdTomato表达的效率与作为阳性对照的全长Cre组相当(图5B)。实验结果表明Rma内含肽介导的S102 Split-Cre系统在小鼠体内能高效介导Split-Cre重组形成具有活性的全长Cre。

图5  体内验证Rma介导的S102 Split-Cre系统的重组活性

Figure 5  In vivo assay of Rma-mediated S102 Split-Cre system. A: The structure of reporting elements of R26-CAG-LSL-tdTomato transgenic reporter mouse; B: Fluorescent images of full-length Cre (AAV8 Cre) and S102 Split-Cre (AAV8 Split-Cre) treated livers of the reporter mice. DAPI was used for showing nucleus.

在基因编辑工具愈发简便且应用越来越广的背景下，Cre重组酶作为一种强大且稳定的基因工程工具，其应用也越来越普遍。根据科学研究的需求，研究人员开发出了Split-Cre系统。Split-Cre系统既可通过与不同的启动子组合应用，使CreN与CreC能够高选择性地在特定细胞系中表达，从而对特定细胞系进行标记^[13-14]，或作为检测多个基因是否同时表达的手段^[15]，也可以作为基因工程工具用于腺病毒载体扩容、双质粒转染细胞筛选等^[16-17]。除了在基础研究领域的应用，目前Split-Cre技术也正在被探索应用于提高转基因食品的安全性方面。例如，该技术可以利用花原基特异性启动子控制Split-Cre片段的表达，在生殖生长阶段删除转基因作物种子和果实中的外源基因，使转基因作物生产的种子和果实不含有转基因作物中的外源基因^[18]。因此，开发高效稳定的Split-Cre系统在基础研究和应用研究中均具有重要意义。

为了使Split-Cre实现高效重组，本研究利用Split-intein介导的蛋白质自剪接系统开发了一套从细胞实验到动物实验水平寻找最佳断裂位点的方法，并筛选出了一个在体内体外均能使Split-Cre进行高效重组的基因断裂位点。在本研究选取的4个位点之中，在S102位点处进行拆分的Cre酶显示出最高的重组成功率。由于本研究中设计的4个拆分位点在Cre编码序列中分布比较集中，因此不排除有其他更高重组效率的拆分位点的可能性。本研究目前通过间接的表征结果验证了这一现象，其背后的机理可能与Cre酶蛋白质结构特征和所选择的Split-intein的自剪接性质有关，进一步深入研究可以揭示Cre酶蛋白质结构特点与拆分位点相应的重组成功率之间的关系。无论是通过针对Cre蛋白结构的分析揭示拆分位点与相应重组成功率之间关联的背后原理，进而得到重组成功率最高的拆分位点，还是通过不同种类的Split-intein的自剪接特性进行设计，均可在本研究的基础上进一步提高Split-Cre系统的效率，为Split-Cre技术的使用提供一个最佳的拆分方案。

综上所述，本研究开发了一套在细胞水平和动物水平均能高效表达的内含肽介导的Split-Cre系统，为遗传细胞谱系示踪和精准转基因等基础和应用研究提供了新的有力工具。

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——中文期刊联合编辑部出品