华泽兰中2个新的苯并呋喃类化合物及其活性研究

华泽兰Eupatorium chinense L.，隶属于菊科（Asteraceae）泽兰属草本，部分地区也呈现半灌木形态，常见别名包括土牛膝、多须公及斑骨相思^[1]。华泽兰主根系发达，多生于山坡林缘、路旁及灌丛中，在我国南方地区分布广泛，尤以广东、广西、湖南、湖北及福建等省区资源丰富^[2]。华泽兰是中医临床常用药材，主要用于清咽利喉，防治白喉，是喉科常用中药；此外，还具有清热解毒作用，可用于治疗扁桃体炎和咽喉炎^[3-4]。《福建药物志》等书籍记载华泽兰具有“舒肝解郁、开胸利膈”的功效，在江浙一带，民间常用华泽兰根切成饮片泡茶，可以有效控制血糖升高^[5]。据研究显示，华泽兰中已分离鉴定出苯并呋喃类（如泽兰素）、黄酮类（如槲皮素衍生物）、萜类（如泽兰烯）、生物碱等活性成分^[6]。现代药理学研究证实，华泽兰的药理作用呈现抗炎、免疫调节、抗病原生物、抗肿瘤、抗糖尿病、抗抑郁等多靶点特性。现代药理对华泽兰的研究集中于抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌等方面^[7-8]，但对抗糖尿病和抗阿尔茨海默病活性研究较少^[9-11]，还需进一步研究。传统经验表明，华泽兰在民间抗抑郁与降糖领域具有显著应用价值。为系统解析其物质基础，本研究采用现代分离技术对其化学成分进行系统鉴定，并建立α-葡萄糖苷酶与乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AchE）的活性评价体系，以发现新的降糖先导化合物并拓展其药用价值。苯并呋喃类化合物是一类由苯环与呋喃环稠合而成的芳香性杂环化合物，广泛存在于自然界中，例如许多植物、真菌和微生物的代谢产物中。大多数苯并呋喃类化合物具有多种生物活性^[12]，包括抗癌^[13]、抗菌、抗结核^[14]、抗炎、抗惊厥^[15]、抗病毒^[16]、抗氧化、抗糖尿病及受体拮抗作用^[17-19]。

苯并呋喃单体是华泽兰化学成分组成的主要化合物之一，深入开展华泽兰苯并呋喃类成分的研究，不但可以丰富植物华泽兰的化合物数据库组成内容，也有助于从华泽兰中得到潜在的中药来源的先导化合物，让华泽兰成为宝贵的药物开发资源。通过对华泽兰根部化学成分进行分离鉴定及其药理活性进行研究，共分离得到6个苯并呋喃类化合物（图1），分别鉴定为(2S,3R)-2-((R)-1,2-二羟丙- 2-基)-3-羟基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基乙酮[(2S,3R)-5-acetyl-2-((R)-1,2-dihydroxypropyl)-2,3-dihydro- benzofuran-3-ol，1]、(2R,3S)-3-羟基-2-(2-羟基-2-丙基)-7-甲氧基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基乙酮[(2R,3S)-5-acetyl-7-methoxy-2-(2-hydroxyprop-2-yl)-2,3-dihydro-benzofuran-3-ol，2]、12,13-二羟基泽兰素（12,13-dihydroxyeuparin，3）、泽兰酮（euparone，4）、泽兰素（euparin，5）、(2S,3R)-7-羟基紫杉醇[(2S,3R)-7-hydroxytoxol，6]。其中，化合物1和2为新化合物，命名为泽兰苯并呋喃F和兰苯并呋喃H；化合物6为首次从华泽兰植物中分离得到。活性结果显示，化合物2、5和6具有较明显α-葡萄糖苷酶抑制活性，化合物1、3～5具有较明显的AchE抑制活性。

1  仪器与材料

Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）；Ultimate 3000 RS Pump（日本岛津公司）；YMC-Pack ODS-AQ C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，日本YMC公司）；Bruker AYANCE 400 MHz核磁共振波谱仪（美国Bruker公司）；TECAN infinite F 200 PRO（酶标仪瑞士帝肯公司）；正相色谱硅胶（烟台化学工业研究所）；反相色谱硅胶（苏州硒诺唯新新材料有限公司）；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA，上海Macklin公司）；对硝基苯基磷酸酯（pnitrophenyl phosphate，pNPP，上海Macklin公司）；碘代硫代乙酰胆碱（上海Macklin公司）；对硝基-b-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl β-D-galactopyranoside，PNPG，上海Macklin公司）；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS，上海Macklin公司）；Na₂CO₃（天津Kemel公司）；α-葡萄糖苷酶溶液（合肥巴斯夫生物科技有限公司）；AChE溶液（Sigma公司）；磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS，Thermo Fisher Scientific Inc）；5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) [5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)，DTNB，上海源叶试剂有限公司]；阿卡波糖（批号A129816，Aladdin公司）；多奈哌齐（批号H20183417，浙江华海药业股份有限公司）。

药材于2021年10月采自湖北省长阳土家族自治县，经三峡大学生物技术中心王玉兵教授鉴定为华泽兰E. chinense L.的根，植物标本（编号TRCW20211031）现保存于天然产物研究与利用湖北省重点实验室（三峡大学）。

2  提取与分离

取干燥华泽兰根部（10.00 kg），粉碎后以95%工业乙醇加热回流提取3次，每次6 h。提取液减压浓缩得总浸膏323.50 g，经挥发除醇并干燥后，加纯水悬浮分散。依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇对悬浮液进行萃取，各取5次。萃取液分别减压浓缩，得到石油醚部位浸膏（91.33 g）、醋酸乙酯部位浸膏（51.57 g）和正丁醇部位浸膏（60.00 g）。

取正丁醇部位浸膏（60.00 g），加300 g去离子超纯水超声溶解。将1 000 g D101型大孔吸附树脂用超纯水浸泡6 h后装柱，超纯水冲洗至柱面稳定，放液至液面高于填料约2 cm，湿法上样并静置过夜吸附。随后以50%乙醇水溶液洗脱至洗脱液无色，洗脱液减压浓缩得浸膏40.20 g。

取上述浸膏（40.20 g），用少量甲醇溶解后与100 g反相硅胶（200～300目）拌匀。采用湿法装柱：将1.2 kg反相硅胶用10%甲醇-90%超纯水溶液浸泡均匀，装入1 L色谱柱，并用同一溶剂冲洗至柱面稳定。随后采用干法上样，控制柱内液面略高于填料约3 cm，均匀加入拌样硅胶，上覆脱脂棉保护。依次以10%、15%、20%、30%、40%、60%、80%、100%甲醇-超纯水进行梯度洗脱，各梯度洗脱3个柱体积，洗脱液经减压浓缩后得8个流分（Fr. A～H）。

取20%甲醇-80%超纯水洗脱部位Fr. C，经HW-40F凝胶柱（甲醇-水20∶80）分离，得22个片段（Fr. C.1～C.22）。Fr. C.16通过半制备HPLC纯化，获得化合物1（6.1 mg）和6（2.1 mg）；Fr. C.19经同样处理得化合物2（2.0 mg）。取40%甲醇-60%超纯水洗脱部位Fr. E，经HW-40F凝胶柱（甲醇-水40∶60）分离，得20个组分（Fr. E.1～E.20）。Fr. E.11经半制备HPLC得4个片段（Fr. E.11.1～E.11.4）；Fr. E.12经重结晶得化合物3（158.3 mg），其结晶母液与Fr. E.14合并供后续分离。

取醋酸乙酯部位浸膏（51.57 g），经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（100∶0→0∶100）梯度洗脱，各梯度3个柱体积，减压浓缩得8个流分（EA.Fr. A～H），由EA.Fr. E分得化合物4（200.3 mg）。取石油醚部位浸膏（91.33 g），用适量石油醚溶解后拌样，同法湿法装填1 L硅胶柱，以石油醚平衡后干法上样。依次以石油醚-醋酸乙酯（90∶10→0∶100）梯度洗脱，浓缩后得7个流分（PE. Fr. A～G），由PE. Fr. D分得化合物5（2 900 mg）。

3  结构鉴定

化合物1：黄色油状液体。[α]25 D−6.9°（c 0.15，甲醇）， (nm):201, 224, 278； (cm⁻¹): 3 472, 2 870, 1 690, 1 357, 1 136；由高分辨质谱HR-ESI-MS m/z: 253.106 8 [M＋H]⁺（C₁₃H₁₇O₅，calcd. 253.107 1），确定其分子式为C₁₃H₁₆O₅，不饱和度为6。分析化合物1的¹H-NMR谱（表1）得知有3个烯烃质子信号δ_H 7.94 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-4), 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-7), 7.87 (1H, dd, J = 8.5, 1.9 Hz, H-6)、2个甲基信号δ_H 0.97 (3H, s, H-14), 2.52 (3H, s, H-11)。化合物1的¹³C-NMR谱和DEPT135谱中（表1），显示有14个碳信号，其中有2个甲基碳信号δ_C27.0 (C-11), 20.1 (C-14)；3个连氧碳信号δ_C72.8 (C-12), 70.8 (C-3), 66.6 (C-13)；通过DEPT135图谱得知3个连氧的碳信号中，有1个连氧原子的亚甲基碳信号δ_C66.6 (C-13)；1个羰基碳信号δ_C196.5 (C-10)；6个烯烃碳信号δ_C 164.4 (C-8), 131.67 (C-6), 131.7 (C-9), 130.6 (C-5), 126.7 (C-4), 109.8 (C-7)。化合物1与文献中报道的化合物megapodiol^[20]的¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱数据高度相似，表明该化合物与文献所报道的化合物都属于苯并呋喃类似物。通过对比二者¹³C-NMR谱数据，该化合物与文献化合物的差别在于少了1个亚甲基信号δ_C 29.6 (C-3) 而多了1个连氧的叔碳信号，提示化合物的C-3位置上连有1个羟基。在HMBC谱中可观察到δ_H 7.94 (H-4) 与δ_C 70.8 (C-3) 有相关，δ_C 72.8 (C-12) 与δ_H 5.33 (H-3) 有相关，证实在C-3位置上存在1个羟基。HMBC谱中，观察到H-11和C-10、C-5之间，H-4和C-3之间，H-13和C-3之间存在相关性；¹H-¹H COSY谱中，H-2和H-3之间有相关性，综合分析该化合物的二维图谱，确定了该化合物的平面结构（图2）。

在NOESY谱图中，观察到H-13和H-2、H-3有相关信号，并通过文献数据^[21]总结，如果H-2和H-3的偶合常数比较小（J_H-2-H-3≤2.0 Hz），则2位和3位的氢原子处于反式构型；如果H-2和H-3的偶合常数比较大J_H-2-H-3≥4.0 Hz，则2位和3位的氢原子处于顺式构型。观察到该化合物的H-2和H-3的偶合常数比较大，为J_H-2-H-3＝4.3 Hz，说明2位和3位的氢原子处于顺式构型。最终，化合物1的相对构型得到确定。其绝对构型，通过TD-DFT理论计算ECD图谱与实验ECD图谱（在220 nm有负Cotton效应，在280有正Cotton效应）对比（图3），确定C-2、C-3、C-12的构型分别为2S, 3R, 12R，通过Scifinder检索可知其为新化合物，命名为泽兰苯并呋喃F。

化合物2：黄色油状液体，[α]25 D−5.6°（c 0.12，甲醇）， (nm):211, 235, 283； (cm⁻¹): 3 451, 2 370, 1 730, 1 343, 1 128；由高分辨质谱HR-ESI-MS m/z: 267.123 2 [M＋H]⁺（C₁₄H₁₉O₅，calcd. 267.122 7），确定其分子式为C₁₄H₁₈O₅，不饱和度为6。根据化合物2的¹H-NMR谱（表1）来看，可观察到有2个烯烃质子信号δ_H 7.43 (1H, d, J = 1.1 Hz, H-6), 7.61 (1H, d, J = 1.1 Hz, H-4)，3个甲基信号δ_H 1.12 (3H, s, H-13), 1.17 (3H, s, H-14), 2.53 (3H, s, H-11)。结合图谱分析，化合物2的¹³C-NMR谱和DEPT135谱中，共显示有14个碳信号，其中有3个甲基碳信号δ_C27.0 (C-11), 26.2 (C-14), 25.8 (C-13)；3个连氧碳信号δ_C71.9 (C-3), 70.1 (C-12), 98.5 (C-2)、1个甲氧基信号δ_C56.2 (C-15)、1个羰基碳信号δ_C196.6 (C-10)、6个烯烃碳信号δ_C112.5 (C-6), 153.3 (C-8), 119.9 (C-4), 144.3 (C-7), 132.0 (C-5), 131.2 (C-9)，通过DEPT135图谱得知没有亚甲基碳信号。化合物2与文献中报道的化合物megapodiol^[20]的¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱数据高度相似（表1），表明化合物2与该文献所报道的化合物属于结构类似物。

通过对比二者¹³C-NMR谱数据，化合物2的与该化合物的差别在于化合物2多了1个甲氧基的碳信号δ_C 56.2 (C-15)，并且在甲基碳信号无变化的情况下，多出了1个连氧的碳信号，且DEPT135图谱显示无亚甲基信号，于是提示化合物2的C-3位置从原来的亚甲基变为连有1个羟基，C-3位置成为连氧的叔碳原子，C-10位置侧链连有1个甲基，C-10从原来的醛基碳变成羰基碳。在HMBC谱中可观察到H-14与C-2之间，H-4与C-3、C-5、C-9、C-10之间，H-15与C-6、C-8之间存在相关性；¹H-¹H COSY谱中，H-3与H-2之间有相关性，综合分析化合物二维图谱，确定了化合物2的平面结构（图2）。

在NOESY谱图中观察到H-2和H-3有相关信号，同时该化合物的H-2和H-3的偶合常数比较大，为J = 4.5 Hz，说明2位和3位的氢原子处于顺式构型，H-2和H-3处于同侧，最终，化合物2的相对构型得到确定。其绝对构型，通过TD-DFT理论计算ECD图谱与实验ECD图谱（在218、236和276 nm有正cotton效应）对比（图3），确定C-2、C-3的构型分别为2R,3S，通过Scifinder检索可知其为新化合物，命名为兰苯并呋喃H。

化合物3：黄色针状晶体（甲醇），分子式C₁₃H₁₄O₅，ESI-MS m/z: 251.1 [M＋H]⁺。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.35 (1H, s, 6-OH), 8.18 (1H, s, H-4), 7.06 (1H, s, H-7), 6.71 (1H, s, H-3), 3.63 (1H, dd, J = 10.7, 6.0 Hz, H-11a), 3.50 (1H, dd, J = 10.6, 5.9 Hz, H-11b), 2.66 (3H, s, H-14), 1.46 (3H, s, H-12)；¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 205.2 (C-10), 163.0 (C-2), 162.0 (C-8), 158.1 (C-6), 123.6 (C-4), 121.6 (C-9), 115.2 (C-5), 102.8 (C-3), 99.2 (C-7), 71.5 (C-12), 68.5 (C-13), 27.8 (C-11), 24.0 (C-14)。以上数据与文献对比一致^[22]，通过测试该化合物的CD数据，发现其在238 nm处有正Cotton效应，在381 nm处有负Cotton效应，确定了该化合物10号位上的碳原子构型为R型。故鉴定化合物3为12,13-二羟基泽兰素。

化合物4：黄色粉末，分子式C₁₂H₁₀O₄，ESI-MS m/z: 219.1 [M＋H]⁺。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.65 (1H, s, H-4), 7.51 (1H, s, H-3), 7.34 (1H, s, H-7)；¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 196.7 (C-10), 185.2 (C-12), 160.5 (C-8), 156.3 (C-6), 152.7 (C-2), 128.0 (C-4), 121.5 (C-5), 114.0 (C-9), 112.4 (C-3), 95.6 (C-7), 27.0 (C-11), 25.1 (C-13)。以上¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱与文献对比一致^[23]，故鉴定化合物4为泽兰酮。

化合物5：黄色针状晶体（甲醇），分子式C₁₃H₁₂O₃，ESI-MS m/z: 217.1 [M＋H]⁺。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 11.58 (1H, s, 6-OH), 7.71 (1H, s, H-4), 6.82 (1H, s, H-3), 6.57 (1H, s, H-7), 5.82 (1H, s, H-14a), 5.23 (1H, s, H-14b), 2.96 (3H, s, H-13), 2.32 (3H, s, H-11)；¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 204.8 (C-10), 162.2 (C-8), 158.4 (C-6), 156.5 (C-2), 133.1 (C-12), 124.5 (C-4), 122.9 (C-5), 115.2 (C-9), 114.8 (C-14), 103.1 (C-7), 98.8 (C-3), 27.4 (C-11), 18.8 (C-13)。以上¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱与文献报道一致^[24]，故鉴定化合物5为泽兰素。

化合物6：无色油状物，C₁₃H₁₄O₄，ESI-MS m/z: 235.1 [M＋H]⁺。¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.60 (1H, s, H-4), 7.39 (1H, s, H-6), 5.33 (1H, d, J = 3.6 Hz, H-3), 5.17 (1H, s, H-2′a), 4.82 (1H, d, J = 3.6 Hz, H-2), 4.77 (1H, s, H-2′b), 2.36 (1H, s, H-9), 1.65 (1H, s, H-3′)；¹³C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 198.6 (C-8), 152.4 (C-7a), 140.7 (C-1′), 140.6 (C-5), 131.3 (C-7), 129.1 (C-4a), 119.1 (C-4), 117.7 (C-6), 113.0 (C-2′), 95.1 (C-2), 76.3 (C-3), 26.3 (C-9), 17.2 (C-3′)。以上¹H-NMR谱和¹³C-NMR谱与文献报道一致^[25]，故鉴定化合物6为(2S,3R)-7-hydroxytoxol。

4  酶抑制活性测试

4.1  α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

α-葡萄糖苷酶的测定方法根据Tao等^[26]方法进行改良，96孔板中依次加入80 μL样品溶液（PBS 稀释，pH 7.2），20 μL α-葡萄糖苷酶溶液（PBS 稀释，0.1 U/mL）混合均匀后，在37 ℃下孵育15 min，加入20 μL反应底物PNPG（5 mmol/L），于37 ℃条件下反应15 min，加入80 μL Na₂CO₃水溶液（0.2 mol/L）以终止反应，即刻使用酶标仪记录405 nm下的吸光度（A）值。参照文献方法^[26]设置酶活性组：20 μL α-葡萄糖苷酶＋80 μL反应缓冲液＋20 μL底物，酶空白组：100 μL反应缓冲液＋20 μL底物，样品组：80 μL样品（50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL）＋20 μL α-葡萄糖苷酶＋20 μL底物，样品空白组：80 μL样品（50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL）＋20 μL反应缓冲液＋20 μL底物，阳性药组：80 μL阿卡波糖（50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL）＋20 μL α-葡萄糖苷酶＋20 μL底物。按照公式计算抑制率，用Origin软件对计算化合物的半数抑制浓度（median inhibition concentration，IC₅₀）值。

抑制率＝1－(A_样品－A_样品空白)/(A_酶活性－A_酶空白)

对前期分离得到的6个化合物进行α-葡萄糖苷酶活性测定，结果显示化合物2、5和6具有较明显α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC₅₀＜20 μg/mL）且化合物2和6的活性均优于阳性药阿卡波糖（IC₅₀＝2.93 μg/mL），其IC₅₀值分别为0.15、1.30 μg/mL（表2）。

4.2  AChE抑制活性测定

采用Ellman^[27]法测定化合物的AChE抑制活性。96孔板测试孔中依次加入PBS（pH 7.2）100 μL，20 μL底物（碘代硫代乙酰胆碱，1.2 mmol/L，PBS配制），20 μL样品（PBS稀释，pH 7.2），20 μL AChE酶（PBS稀释，0.05 U/mL）后37 ℃下孵育30 min，随即加入4% SDS（pH 7.2）以终止反应，立即加入DTNB进行显色。使用酶标仪记录405 nm下A值。

参照文献方法^[27]设置酶活性组：100 μL PBS＋20 μL底物＋20 μL样品（100、50、25、12.5、6.25 μg/mL）＋20 μL酶，酶空白组：120 μL PBS＋20 μL底物＋20 μL样品（100、50、25、12.5、6.25 μg/mL），样品空白组：100 μL PBS＋20 μL底物＋20 μL酶＋20 μL酶，阳性对照组：100 μL PBS＋20 μL底物＋20 μL多奈哌齐（10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL）＋20 μL酶。按照公式计算抑制率，用Origin软件对计算化合物的IC₅₀值。

5  计算机辅助模拟分子对接

本研究将化合物2、5、6和阳性药阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶蛋白进行分析对接，作用类型为氢键、疏水键、盐键相互作用、π-π堆积作用。数据结果表明，以上化合物与靶点蛋白存在很好的结合作用且匹配度高（表4），结合能均小于−5 kcal/mol。将对接后化合物与蛋白形成的复合物利用Pymol2.1软件进行可视化，得到化合物与蛋白的结合模式，根据结合模式可以很清晰地看到化合物与蛋白口袋的相结合的氨基酸残基。化合物2和酶蛋白活性位点的PHE-144、PHE-282、ASP-327氨基酸形成了疏水键的相互作用力，和ASP-60、GLN-256、ASP-327、GLN-328、ARG-411氨基酸形成氢键的相互作用力；化合物5：和酶蛋白活性位点TYR-63、ILE-143、PHE-163氨基酸位置之间形成了疏水键的相互作用，和HIS-203、GLN-256、ASN-258氨基酸位置之间形成了化合物与蛋白之间氢键的相互作用；化合物6：在酶蛋白活性位点的ILE-143、PHE-225、TYR-63氨基酸位置形成了疏水键的相互作用，和氨基酸ALA-200、HIS-203、GLN-256、ASN-258、ASP-327、ARG-411形成了氢键的相互作用力（图5）。

将化合物1、3～5和阳性药多奈哌齐与AChE靶点蛋白进行分子对接，作用类型为氢键、疏水键、盐键相互作用、π-π堆积作用。分子对接结果表明，以上化合物与靶点蛋白存在很好的结合作用且匹配度高（表5），结合能均小于−5 kcal/mol。将对接后化合物与蛋白形成的复合物利用Pymol2.1软件进行可视化，得到化合物与蛋白的结合模式，根据结合模式可以很清晰的看到，化合物1和酶蛋白活性位点的PRO-403、LEU-532、LEU-528、PRO-529氨基酸之间形成疏水键相互作用力，和HIS-398、ASN-230氨基酸之间形成了氢键的相互作用；化合物3：和酶蛋白活性位点的TRP-279、TYR-70、TYR-334、PHE-331、PHE-330氨基酸位置之间形成了疏水键的相互作用力，和TYR-121氨基酸位置之间形成了氢键的相互作用力；化合物4：和酶蛋白活性位点的TRP-84、TYR-442、TRP-432、PHE-330氨基酸之间形成了疏水键的相互作用力，和SER-200、HIS-440、TYR-334氨基酸之间形成氢键相互作用力；化合物5：在酶蛋白活性位点的PRO-232、TRP-524氨基酸位置之间形成了疏水键之间的相互作用力，和HIS-398氨基酸之间形成氢键之间的相互作用力（图6）。

6  讨论

本研究从华泽兰根部共分离鉴定得到6个苯并呋喃类单体化合物，其中化合物1和2为新化合物。分别为泽兰苯并呋喃F（eupbenzofuran F，1）和泽兰苯并呋喃H（eupbenzofuran H，2）。并且化合物6首次从华泽兰植物中分离得到。经酶抑制活性测试表明化合物2、5和6具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，化合物2和6的抑制活性均优于阳性药阿卡波糖（IC₅₀＝2.39 μg/mL），分析6个化合物的构效关系发现，化合物2和6均在C-7位多了连氧的基团，能显著增强其α-葡萄糖苷酶抑制活性。进一步比较化合物2和6的结构不同，发现甲氧基影响α-葡萄糖苷酶抑制活性。化合物1、3～5具有良好的AChE抑制活性，化合物5的抑制活性接近于阳性药多奈哌齐（IC₅₀＝0.055 μg/mL），该化合物和阳性药多奈哌齐同属于苯并呋喃类化合物，具有良好的成药潜力。进一步利用分子对接技术，发现化合物2、5和6与α-葡萄糖苷酶靶点蛋白、化合物1、3～5与AChE靶点蛋白之间存在氢键、疏水、共轭等多种相互作用力，从而能够与蛋白形成稳定的复合物，与蛋白关联性较强，验证了本研究的活性测试结果。本研究不仅进一步充实了华泽兰的化学成分谱系，更为阐释其抗糖尿病、抗阿尔茨海默病的物质基础奠定了实验基础；由此获得的天然小分子，有望成为防治高血糖、抗阿尔茨海默病的潜在先导化合物，为相关新药研发提供新的资源与思路。