摘要：强制降解研究已成为重组单克隆抗体治疗药物开发不可或缺的一部分，其目标从早期可制造性评估到支持上市前和上市后批准的可比性评估。本综述总结了散布在不同文件中的监管指南，以突出FDA和EMA等各个机构的期望。还讨论了强制降解研究的各种目的、常用条件和每种条件下的主要降解途径。
【NO.1】介绍
强制降解是重组单克隆抗体（mAb）治疗药物研发不可或缺的一部分。从早期候选药物选择到批准后，经常进行强制降解研究，以支持可制造性评估、配方开发、稳定性指示方法的建立和可比性。重组mAb的降解会对产品质量、安全性和有效性产生负面影响，因此如果发生降解，则需要进行检测。强制降解研究提供了深入了解分子的生化和生物物理特性的机会，包括从实时和加速条件下进行的稳定性研究中未观察到的主要降解途径。尽管强制降解研究是在短时间内在相对恶劣的条件下进行的，但收集到的信息可以提供高度相关的数据来支持实时环境条件。
本文特别关注了重组mAb治疗药物。它讨论了强制降解研究的目标、常用条件以及每种条件下的主要降解途径。它进一步总结了在不同发育阶段为各种目标而常用的各种类型的强制降解研究。此外，它还广泛审查了当前的指导文件。
【NO.2】强制降解研究的目的
行业通常使用强制降解研究来支持mAb治疗药物在产品的整个生命周期中用于各种目的的开发（表1).各机构还希望通过强制降解研究来了解产品降解途径，并建立稳定性指示方法，以便在保质期内监测降解（如果发生）。此外，强制降解通常用于评估可制造性、方法开发、鉴定和转移、关键质量属性（CQA）评估和产品变体的鉴定。如下所述，强制降解条件与mAb工艺和产品开发作高度相关。
表1.强制降解研究的目的和基本原理
【NO.3】常见强制降解条件下的主要降解途径
常用的强制降解条件包括高温、冻融、搅拌、高pH值、低pH值、光照、氧化和糖基化。然而，与实际存储和加速稳定性条件相比，这些条件相对恶劣，可以在短时间内产生相关的降解趋势和降解产物。选择各种条件还取决于商品在加工、包装、运输和处理过程中可能暴露于这些有害条件的可能性。
主要降解途径总结为图1.最常见的降解途径是聚集、碎裂、脱酰胺和氧化。在特定条件下，有限的降解途径可能成为主导。例如，高pH条件会触发与二硫键相关的降解途径，例如由于二硫键加扰而形成硫醚或共价聚集体。与还原糖孵育主要导致表面暴露的赖氨酸残基糖基化。以下各节将进一步讨论每种条件下的常见和独特降解途径。
图1.重组单克隆抗体的主要降解途径。箭头表示主要降解部位。检测降解产物的常用方法显示在括号中
3.1高温
稳定性研究通常在正常储存、加速或中等温度条件下进行。相比之下，热应力下的强制降解通常在超过标称存储和加速稳定性条件下进行。例如，如果mAb产品的预期长期储存条件为2–8°C，加速稳定性为25°C，则热应力条件可能为35°C或更高。使用高温的目标是在短时间内（例如一周）产生大量降解。可以通过确定通过热稳定性技术（如差示扫描量热法）测量的去折叠温度来选择适当的高温，或者最好通过进行预筛选研究来选择适当的高温。高温胁迫是提供有关预期储存条件下潜在长期降解信息的最相关条件之一。
高温会加速各种降解途径。高温条件导致的主要降解途径之一是聚集体的形成，包括不溶性（沉淀物和颗粒）和可溶性聚集体。要么是共价的，要么是非共价的。聚集体的机制和类型因pH值等因素而异和盐。另一个主要的高温诱导降解途径是肽键切割产生的碎裂。抗体的片段化主要由非酶反应催化。污染蛋白酶催化碎裂的情况很少见，因为原料药通常是高度纯化的。铜和铁也可以催化碎裂。主要的碎裂位点在铰链区周围，在较小程度上围绕域-域接口。其他位点碎裂，例如两个天冬氨酸残基之间和两个丝氨酸残基在互补决定区3（CDR3）以及CH2结构域的天冬氨酸残基和脯氨酸残基之间也有报道。有趣的是，CH2结构域中天冬氨酸和脯氨酸之间的裂解导致聚集体的形成，表示化学和物理改性的依赖关系。碎裂高度依赖于pH值，在pH值6附近碎裂水平最小，而pH值较低和高pH值已被证明可以加速碎片化。高温还会加速天冬酰胺（Asn）脱酰胺，谷氨酰胺（Gln）脱酰胺，N末端焦谷氨酸形成（pGlu）和蛋氨酸氧化。天冬酰胺脱酰胺的位点因制剂缓冲液的pH值而异。高温会加速天冬氨酸异构化，从而导致在微酸性pH值下形成异天冬氨酸和反应中间体琥珀酰亚胺。使用基于电荷的方法进行分析得出了重要的观察结果，即当重组mAb在高温下孵育时，酸性物质会增加。酸性物质的增加可能是由多种降解机制引起的，包括脱酰胺、N端谷氨酰胺环化和氧化等修饰。在中性和微碱性条件下的高温也会加速二硫键的降解，通过β消除，由于形成硫醚键而形成不可还原的交联物质。
3.2冻融
冻融通常被探索为一种强制降解条件，以确定mAb对温度循环的敏感性。冻融是mAb产品经常面临的压力。例如，原料药通常被冷冻以实现长期储存。作为冻干工艺开发的一部分，药品可能会暴露在冷冻温度下。
化学降解不是冻融应激的主要降解途径，因为原料药暴露在室温下的时间很短。相反，冻融过程中的主要降解途径是形成各种聚集体，包括沉淀物和颗粒，但主要由二聚体和多聚体组成。冻融诱导的聚集本质上主要是非共价的并且高度依赖于pH值，缓冲液浓度辅料盐蛋白质浓度以及冷却和升温速率等作参数。
3.3搅拌
mAb在生产过程中遇到的另一个物理应力是搅拌应力。了解mAb对搅动的敏感性非常重要，因为它可能在单元作（包括细胞培养、纯化、配方、产品灌装和运输）中暴露于这种条件下。通常评估mAb对搅拌（如搅拌或摇晃）的敏感性，以支持配方和工艺开发。搅动会增加mAb与疏水界面（如气-液或液-表面界面）接触的可能性。
摇动抗体引起的主要降解途径是形成不溶性抗体和可溶性聚集体，两者都可以是共价或非共价的。非天然二硫键的形成是可还原共价聚集的主要原因。摇动诱导的聚集也高度依赖于样品的pH值，盐类赋形剂，如聚山梨酯、摇晃速率以及容器类型和大小。
与振荡类似，搅拌引起的主要降解产物也是聚集（可溶性和不溶性）。盐和pH值等因素对形成的聚集体的数量和类型有重大影响。搅拌引起的不溶性聚集体主要是由于非天然二硫键形成的。也有报道称，包括蛋氨酸和色氨酸的氧化在内的化学修饰，可能是由于氧气从顶部空间转移到液体中增加。
通常观察到搅拌和振荡之间降解产物和动力学的细微差异。例如，一项研究表明，摇动和搅拌都会产生沉淀物，摇动会产生可溶性聚集体和颗粒，而搅拌会产生更多的颗粒，但可溶性聚集体更少。另一项研究表明，摇动会产生不溶性和可溶性聚集体，但搅拌主要产生不溶性聚集体。在设计搅拌研究时，重要的是要根据过程相关性同时考虑搅拌和振荡。
3.4低pH值
低pH值是一种需要评估的重要应激条件，因为mAb纯化过程通常涉及暴露于酸性溶液条件下，例如在蛋白A色谱洗脱和常用的低pH病毒灭活期间。因此，使用低pH值的强制降解研究可以使用纯化过程中的pH值作为参考点。
低pH值导致可溶性，和不溶性聚集体，并加速碎片化。碎裂的主要位点位于铰链区，这导致形成在非还原条件下分子量为∼40-50kDa，在还原条件下分子量为∼20-30kDa的片段。如前所述，一项研究表明，低pH值诱导的天冬氨酸和脯氨酸之间的裂解发生在CH2结构域，从而导致聚集体的形成。低pH值还导致天冬氨酸异构化导致琥珀酰亚胺的积累。
在实践中，mAb暴露于低pH值下会导致沉淀，尤其是在原料药中发现的高蛋白浓度下。虽然了解产品在特定的低pH值下是否容易完全沉淀很重要，但建议加入不会导致完全沉淀的略高pH值条件，以有效评估pH值对产品稳定性的影响，并帮助确定降解途径。
3.5高pH值和强制脱酰胺
与低pH值类似，评估高pH值条件对于全面了解和识别降解途径非常重要。在纯化过程中，在阴离子交换色谱作过程中使用高pH值洗脱缓冲液。此外，在蛋白A洗脱和低pH病毒灭活后的pH中和步骤中，mAb可能会短暂地暴露在高pH值下。高pH值应力通常使用pH值（如8或9）进行。然而，在某些情况下，可能需要更高的pH值（例如pH10）来确定位于不同位点的天冬酰胺残基的脱酰胺敏感性。
高pH值应激的一个标志性指标是天冬酰胺脱酰胺，通过基于电荷的方法观察到条带/峰的酸性偏移。重组mAb的常见脱酰胺位点位于Fc的所谓“便士”肽SNGQPENNY中。CDR中的脱酰胺也有报道。“penny”肽中的脱酰胺水平为比较其他天冬酰胺残基的脱酰胺敏感性提供了很好的参考点。
高pH值孵育通常会导致聚集，形成不溶性和可溶性聚集体，以及碎片化加速。主要的肽键水解位点位于铰链和结构域-结构域界面周围。高pH值还会导致二硫键降解，导致形成脱氢丙氨酸、游离巯基、硫醚和D-半胱氨酸。
3.6光
光照是一个关键的环境因素，通常会影响产品的所有阶段，从细胞培养到患者给药。因此，研究光照对产品质量的影响非常重要。与其他强制降解条件不同，光稳定性在ICH指南ICHQ1B中定义。但是，应调整条件以达到mAb的适当降解水平。氨基酸残基色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和半胱氨酸以及肽骨架是最容易受到光诱导降解的位点。
由于光照引起的主要降解途径是聚集体的形成，它们主要是共价的。光暴露导致铰链区域周围碎裂也很常见。正如预期的那样，几个残基包括色氨酸、蛋氨酸和组氨酸高度敏感，并因光照而被氧化。色氨酸残基的氧化导致形成多种产物，其中主要产物的分子量增加16Da和32Da。已报道的其他修饰包括天冬酰胺酰胺化和共价交联。CDR区残基的氧化和脱酰胺可能与活性丧失有关。有趣的是，光诱导氧化优先发生在同一重链的残基上，而与过氧化氢孵育会导致随机氧化，提示不同的机制。一项研究报告称，在Fe（II）存在下，光照会导致柠檬酸降解，并导致重组抗体N端和赖氨酸侧链胺基团发生丙酮化。
3.7氧化
重组mAb经常暴露在氧化环境中，包括溶解氧、空气中的氧气和自由基，例如与金属和原材料中的杂质（例如过氧化物）反应产生的自由基。强制氧化用于探测易氧化的残基，并了解这种降解途径是否有实际影响，例如，CDR中残基的氧化可能会影响结合和效力。最常用的方法是将重组mAb与过氧化氢或叔丁基过氧化氢一起孵育以制备蛋氨酸残基，和2,2′-偶氮双（2-脒基丙烷）二盐酸盐用于色氨酸。
通过将mAb与氧化性试剂一起孵育而强制氧化的主要降解产物是蛋氨酸残基氧化生成蛋氨酸亚砜，分子量增加16Da，在较小程度上生成蛋氨酸砜，分子量增加32Da。研究表明，CH2结构域中的一个蛋氨酸残基（Met252，在DTLMISR的氨基酸序列中）和另一个（Met428，在SVMHEA的氨基酸序列中）在CH3结构域中是最易氧化的残基，在光稳定性条件下和与氧化试剂孵育时，很可能是因为它们的表面暴露水平很高。虽然蛋氨酸残基的氧化是主要的降解途径，但过氧化氢也会导致mAb碎裂。氧化导致形成不溶性和可溶性聚集体，这可能是由于氧化诱导的构象变化。
值得一提的是，常用的强制氧化条件可能无法完全代表在实时条件下发生的氧化。与氧化摄流剂孵育导致形成随机分布在2个重链中的蛋氨酸亚砜，而在加速稳定性样品中观察到同一重链上易感蛋氨酸残基的氧化。这些数据表明，强制氧化和加速条件涉及不同的机制。然而，强制氧化研究可以揭示易感残留物和降解产物，这与证明检测氧化的方法能力高度相关。
3.8糖基化
糖基化是还原糖与抗体轻链和重链的赖氨酸侧链和N末端伯胺基团之间的非酶促反应。糖基化的直接作用是修饰蛋白质的N末端胺和赖氨酸侧链，每个糖基化位点的分子量增加162Da。糖化水平在很大程度上取决于蛋白质浓度、温度、pH值、糖类型、糖浓度、暴露时间和游离氨基酸浓度。如果存在暴露的赖氨酸残基（例如，在CDR中），则在强制降解研究期间应考虑糖基化，这可能会影响结合和疗效。此外，糖基化会导致聚集并且可以使分子更酸性。晚期糖基化终产物的形成也会导致产物着色，并与各种疾病状态蛋白有关。
重组mAb在许多生产步骤中都会暴露于还原糖中，尤其是在细胞培养过程中，当糖用作营养物质时。虽然非还原糖通常用于配方，但它们有可能降解成还原糖，从而对胺基产生反应。此外，抗体在根据稀释剂（例如葡萄糖溶液）给药期间或给药后由于与血液中的糖反应而发生糖化。
【NO.4】强制降解研究的预筛选和应用
4.1预筛选
监管指南中没有关于强制降解中使用的特定条件的程序，但Q1B中定义的光稳定性除外。然而，对于mAb，Q1B条件太严重，因此应通过实验确定光稳定性强制降解研究。预筛选的目标是确定导致有意义降解水平的最佳条件。降解过少不能清楚地展示降解途径和动力学，而降解过少并不能代表现实生活场景。
预筛选通常以较少的时间点进行，并使用选定的释放和表征分析，如表2.选择合适的检测方法很重要，因为每种检测方法都有其自身的优点和局限性。尺寸排阻色谱（SEC）和毛细管电泳十二烷基硫酸钠（CE-SDS）等灵敏纯度分析均可测量单体/主要物质，但SEC可能对聚集体更敏感，因为它同时检测共价和非共价聚集体，而CE-SDS只能检测共价聚集体。这两种检测都是在预筛选期间使用的合理选择。相比之下，结合测定在表征纯度的非显着变化时可能不敏感。因此，预筛选可能不需要结合测定。
表2.推荐的预筛选条件和方法
SEC是检测聚集和较小程度的碎裂的首选方法。基于电荷的方法（如阳离子交换色谱或等电聚焦电泳）在检测分子的整体变化时非常敏感，主要是由于脱酰胺反应，但也是由于其他修饰。完整分子量或还原分子量的液相色谱-质谱（LC-MS）分析对于检测氧化和糖基化等修饰也非常有用。
在预筛选期间评估的样品应尽可能接近最终配方产品。此要求背后的基本原理是多方面的。首先，降解途径和动力学高度依赖于样品特性，例如浓度、pH值、盐和赋形剂。其次，从强制降解研究中获得的数据应与最终原料药或药品相关，第三，为特定制剂基质开发的分析方法（例如离子交换色谱法）对于不同的溶液条件可能不可靠。如果它们在科学上是合理的，可能会有例外。为了支持可比性研究，只要变化前和变化后的浓度彼此匹配，使用与原料药浓度不同的变化前批次和后批次进行的强制降解研究就可以进行相对比较。
4.2强制降解研究的应用
强制降解研究是根据研究目标和预筛选结果设计的。例如，在预配制过程中，通常使用搅拌来确定聚山梨酯的适当水平，以防止聚集。这项研究可以很简单，只需用不同水平的聚山梨酯对样品进行应力处理并监测聚集体的产生。另一方面，为了支持可比性，可以根据工艺变化对产品质量的潜在影响使用多次强制降解，并且很可能有必要进行预筛选研究，以确定导致大量降解的条件，以便评估降解动力学和降解途径。应用领域总结如下表3.
表3.在mAb的整个生命周期中进行强制降解研究的应用领域、目标和分析工具
（1）可制造性
强制降解研究通常用于评估开发候选产品的可制造性。重组mAb的可制造性（也称为“可开发性”或“分子评估”）的目标是评估候选抗体在常用工艺、配方和储存条件下的生化和生物物理特性，例如溶解度、疏水性和稳定性。这样的评估对于选择一个候选人以推进开发非常有用。在最坏的情况下，这可能会触发分子的重新设计，以消除降解的“热点”。
强制降解研究探讨了候选基因的脆弱性，这些候选基因通常已经经过了初步的计算机设计分析，以纠正可能导致游离半氨酸和降解热点等问题的明显结构特征，以及CDR区域中易受腐蚀和氧化位点的问题。此外，可以从分子设计中去除一些特征，例如N端谷氨酰胺和C端赖氨酸，它们没有已知的生物学功能，但可引起异质性。
由于此开发阶段的材料可用性有限以及允许进行此类评估的时间，可制造性强制降解研究的设计可能会受到限制。通常根据分子的先验知识确定应力条件和分析方法的优先级（例如，计算机模拟分析）。从有限的强制降解研究（如热处理和氧化）中可以获得大量信息。建议使用对降解产物敏感的方法，例如用于聚集体的SEC，用于评估多种降解的综合效应（包括常见的mAb脱酰胺）的基于电荷的方法，以及用于特定修饰（如氧化）的LC-MS。小体积和高通量分析技术通常用于筛选多个候选药物。示例包括使用CE-SDS测量纯度和使用毛细管等电聚焦来测量电荷分布的变化。
（2）配方前开发
制剂前研究通常通过测量各种缓冲液、pH值、盐、去污剂和其他赋形剂中的溶解度和热力学稳定性来扩展物理化学特性的知识。在多种溶液条件下进行强制降解研究对于进一步评估mAb的聚集倾向和整体化学稳定性非常重要。这些数据支持为进一步的配方开发活动选择合适的缓冲液和pH范围。
（3）降解途径
生物制品许可申请（BLA）或上市许可申请（MAA）需要确定单个代表性批次的降解途径和概况。包括释放和扩展表征方法，以全面表征在各种强制降解条件下产生的降解产物。表征温度胁迫产生的降解产物可能有助于识别和理解在加速条件下实时发生的降解产物。
对于导致氧化、糖基化和脱酰胺化等特定反应的条件，深入表征非常简单。这些类型修饰的位点和水平可以使用LC-MS轻松确定。表征来自更复杂途径的降解产物通常更具挑战性，例如由高温、低pH值、高pH值和搅拌引起的降解产物。通常使用多种方法来彻底表征这些降解产物。冻融是一种独特的条件，其主要预期影响是聚集体的形成，其中监测颗粒和可溶性聚集体的方法可能很有用，例如SEC、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、颗粒计数和平均荧光强度。
（4）方法开发、确认、验证和转移
强制降解研究是方法开发、确认、验证和转移不可或缺的一部分。放行方法旨在监测和确保常规产品质量，因此应能够检测在各种现实生活条件下发生的产品降解。在分析方法验证中，应使用在高度相关条件下生成的强制降解材料，以确定该方法的稳定性指示能力，以便充分监测产物随时间推移的降解情况。降解产物需要具有相关性，这意味着它们被预测为在实时和加速或偏移条件下发生。从这个意义上说，应优化强制降解条件，以产生降解产物，这些降解产物仅在丰度上不同，而在物种上则不同，就像在真正的加工和储存条件下形成的降解产物一样。
在方法开发中加入强制降解样品可以在早期阶段确定稳定性指示能力。在这一点上，如果方法不能表明稳定性，则仍有机会对其进行足够的改进以达到足够的水平。使用强制降解样品也有助于确定关键方法参数。对于典型的IgG1，最大的片段是没有一个Fab的抗体（约100kDa），根据SEC，它在单体峰后立即洗脱。因此，如果要声称能够检测片段，则检测该峰是SEC方法的最低分离度要求。
强制降解样品通常包含相对高水平的产品变体，包括产品相关物质和产品相关杂质。因此，将这些样品包含在方法定性和转移中可以在更大的参数范围内建立额外的稳定性。
（5）产品变体和降解产品鉴定
强制降解通常用于富集原料药中产品变体和稳定性样品中降解产物的含量，以进行深入表征。需要对产品变体进行彻底表征，以确定其化学性质。由于各种修饰，包括由降解导致产品变体的修饰，重组mAb的异质性很常见。同样，也需要对稳定性样品中存在的降解产物进行全面表征，以了解降解途径。然而，在没有强制降解条件下收集低丰度变体或降解产物是具有挑战性的。
监管期望识别色谱放行测试中的所有峰。强制降解用于富集在原料药/产品中观察到的低丰度峰。对于色谱方法，通常认为峰保留时间与mAb的特异性修饰相关。相同的保留时间表明，在原料药中检测到的变异可能与样品受到应力处理时产生的变异相同。然而，在某些情况下，过程中产生的降解产物与强制降解研究中产生的降解产物不同。一项研究表明，原料药的氧化导致蛋氨酸残基优先在同一重链上氧化，而与过氧化氢孵育导致蛋氨酸残基在两条重链上随机氧化。有趣的是，光诱导氧化也导致蛋氨酸残基优先在一条重链上氧化。在另一个示例中，脱酰胺位点随缓冲液pH值而变化，因此，如果制剂缓冲液的pH值在微酸性至中性范围内，则使用在高pH值下孵育产生的样品可能无法准确预测正常储存条件下的脱酰胺反应。因此，使用强制降解样品来帮助原料药和稳定性样品的峰分离和表征应具有科学依据。
（6）关键质量属性评估支持
ICHQ8（R2）将CQA定义为“物理、化学、生物或微生物特性或特性，应在适当的限度、范围或分布范围内，以确保所需的产品质量。评估质量属性是否为CQA是基于其对效价、安全性和免疫原性的影响，同时考虑不确定性程度。就CQA概念而言，产品变体可分为对安全性和有效性没有影响的产品相关物质，或对产品安全性和有效性有影响的产品相关杂质。对于在原料药中发现的一些低水平产品变体，可以使用强制降解条件来产生更大量的这些变体，以便它们可用于CQA评估。
（7）可比性支持
强制降解研究可能会提供强有力的证据来支持产品的可比性。在压力下评估变化前批次和变化后批次可以揭示常规放行和表征方法无法检测到的细微变化。使用强制降级数据时，可比性是根据两个标准建立的。第一个标准是证明相同的降解途径。通常，可以假设具有相同保留或迁移时间的降解产物具有相同的降解途径。在换货前或换货后批次中出现的独特物种都需要进行彻底的表征，因为它表明由于产品中的细微差异而存在独特的降解途径。第二个标准是可比降解动力学的证明，因为可比批次将具有相同的趋势。对于通过SEC监测的降解，这表现为单体的相当损失以及随时间同时产生聚集体和片段。
可比性的严格性在很大程度上取决于Q5E中推荐的开发阶段。因此，可以根据风险评估和科学论证选择强制降解研究，包括条件、方法和批次数量。潜在的质量属性变化可以从内部经验和文献中合理预测。因此，可以选择可比性的强制降解条件，以包括那些最有可能根据预筛选研究揭示批次间差异的条件。
【NO.5】监管指南
由于强制降解研究可用于多种目的，因此在各种监管指导文件中都可以找到强制降解的各个方面。但是，缺少一个独立的文档。相关指南以及指南中的要点和应用领域总结如下表4并在以下各节中进一步讨论。包括与生物制品相关的指导文件，包括来自美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的文件。人用药品技术要求协调国际会议（ICH）的指导文件也特别重要，因为这些文件反映了监管机构和行业之间通过健全的科学程序进行的协调。
表4.关于强制降解的相关指导文件
5.1 ICHQ5C
国际协调会议关于生物技术/生物制品稳定性测试的Q5C文件指出，“这些产品对环境因素特别敏感，例如温度变化、氧化、光、离子含量和剪切力。为了确保维持生物活性并避免降解，通常需要严格的储存条件。本段认识到，生物制品（如mAb）会受到许多环境因素的影响，这些因素会导致降解，从而导致生物活性丧失。因此，需要研究这些条件以设计合适的配方和储存条件。
该指南还指出，“申请人应为生物技术/生物制品开发适当的支持稳定性数据，并考虑可能影响商品效力、纯度和质量的许多外部条件。确定产品保质期的稳定性计划基于实时储存条件，并在需要时通过加速或中等温度提供额外的保证。要考虑的主要环境因素是温度;但是，该指南认识到，还有许多其他因素会影响药物效力、纯度和质量。这些因素通常包含在典型的强制降解研究中，例如暴露于极端pH值、光照或搅动下。
Q5C进一步指出，“在提交时，申请人应已验证构成稳定性指示配置文件的方法。申请人需要使用相关的降解样品了解降解途径，以建立稳定性指示方法。
最后，Q5C指出“在压力条件下的研究可能有助于确定意外暴露于非建议条件（例如，在运输过程中）是否对产品有害，也有助于评估哪些特定测试参数可能是产品稳定性的最佳指标。对原料药或药品暴露于极端条件的研究可能有助于揭示降解模式;如果是这样，则应在建议的储存条件下监测此类变化。本段表明，将产品暴露于极端条件下有助于识别降解途径并建立能够检测这些降解产物的方法。
5.2 ICHQ1B
Q1B文件提供了进行光稳定性研究的详细信息。原料药光稳定性的整个研究包括2个部分，强制降解和验证性研究。强制降解部分的目标是确定降解途径并支持方法开发。对于这部分，可以使用不同的条件来产生适量的降解产物。验证性研究的目标是为药品的适当加工和处理提供信息。验证性研究对于确定药品处理、包装和标签的适当程序至关重要。该指南指出，样品应暴露于不低于120万勒克斯小时的总能量和不低于200瓦时/平方米的综合近紫外线能量下。该指南建议以顺序方式进行药品光稳定性研究，从完全暴露的药品开始，然后是直接包装中的药品，然后是上市包装中的药品。
5.3 ICHQ6B
ICH文件Q6B指出：“在制定规格时，应考虑储存过程中可能发生的原料药和药品降解。由于这些产品固有的复杂性，没有单一的稳定性指示测定或参数来描述稳定性特性。因此，制造商应提出一个稳定性指示配置文件。这种稳定性指示曲线的结果将保证能够检测到产品质量的变化。本段强调了为给定产品建立稳定性指示谱的重要性，例如，各种条件下的降解途径和适当的方法。因此，强制退化研究具有高度相关性，因为所使用的条件代表了现实生活条件的最坏情况。因此，确定的降解途径代表了储存条件，并允许建立稳定性指示方法来检测储存过程中可能发生的降解产物。
5.4 ICHM4Q（R1）
在稳定性第3.2.S.7节下，该指南指出“应总结进行的研究类型、使用的方案和研究结果。摘要应包括结果，例如，来自强制降解研究和压力条件的结果，以及有关储存条件和重新测试日期或保质期的结论（视情况而定）。它还要求数据以适当的格式呈现。了解强制降解条件下的降解途径对于确保产品在储存条件下的稳定性至关重要。
5.5 ICHQ1A（R2）
Q1A（R2）指出，“原料药的应力测试可以帮助识别可能的降解产物，这反过来又可以帮助确定降解途径和分子的内在稳定性，并验证所用分析程序的稳定性指示能力。降解产物应用于验证方法是否具有稳定性指示，例如，能够检测在储存、运输和使用条件下发生的相关降解产物。
Q1A（R2）还指出，“压力测试可能会对单批原料药进行。它应包括温度（以10°C的增量（例如，50°C、60°C等）高于加速测试的温度）、湿度（例如，75%RH或更高）（如适用）、氧化和光解对原料药的影响。该测试还应评估原料药在溶液或悬浮液中在各种pH值下对水解的敏感性。“同一文件指出，”这些研究的结果将构成提供给监管机构的信息的组成部分。本文档指出，在提交许可证申请时，必须了解降级路径。一个具有代表性的批次可用于全面研究强制降解条件下的降解途径，包括温度、氧化、光稳定性、低pH值和高pH值。
Q1A（R2）进一步指出，“在应力条件下检查降解产物有助于建立降解途径以及开发和验证合适的分析程序。但是，如果已证明某些降解产物不是在加速或长期储存条件下形成的，则可能没有必要专门检查它们。它再次指出，应力条件有助于建立降解途径，从而开发和验证适当的稳定性指示测定。它进一步规定了识别实际存在于长期和加速稳定性条件下的降解产物的要求，而不需要识别那些强制降解条件下特有的降解产物。
总体而言，在提交BLA或MAA时，应包括来自单个批次在各种条件下的强制降解数据，这表明对从降解产物鉴定确定的降解途径有很好的理解。这些降解产物应该用于稳定性指示方法验证。
【NO.6】FDA 2期和3期研究的行业研究性新药申请指南
该指南指出，“如果不提前进行，则应在第3阶段进行应力研究，以证明原料药的固有稳定性、潜在的降解途径以及拟议分析程序的能力和适用性。应力研究应评估原料药在不同pH溶液、氧气和光照以及高温和湿度水平下的稳定性。这些针对单个批次的一次性应力研究不被视为正式稳定性程序的一部分。结果应总结并提交年度报告。该段落指出，除了正式的稳定性程序外，还需要使用一个代表性批次来彻底研究各种应力条件下的降解途径，以提供对分子内在稳定性的理解。这些研究的样品应用于证明分析方法检测降解产物的能力和适用性。
该指南进一步指出，“对于某些药品，可以保证进行一次性压力测试，以评估药品的物理特性（例如，相分离、沉淀、聚集、特定尺寸分布的变化）和/或化学特性（例如，成分的降解和/或相互作用）发生变化的可能性。这些研究可能包括评估高温、潮湿、氧化、光解和/或热循环影响的测试。相关数据应在年度报告中提供。在3期研究期间，原料药和某些药品的降解途径都应包含在年度报告中。
6.1 ICHQ5E
Q5E提供了关于使用强制降解研究以支持原料药和药品可比性的指南。对于原料药，该指南通过以下陈述强调了在可比性研究中纳入稳定性的重要性：
“需要稳定性，包括由加速或应力条件产生的稳定性，以便深入了解产品降解途径中的潜在产品差异，从而了解产品相关物质和产品相关杂质的潜在差异。”
“任何可能改变蛋白质结构或纯度和杂质谱的变化都应该评估其对稳定性的影响，因为蛋白质通常对变化很敏感，例如对缓冲液组成、加工和保存条件以及有机溶剂的使用所做的变化。此外，稳定性研究可能能够检测到表征研究不容易检测到的细微差异。
“加速和应力稳定性研究通常是建立降解曲线的有用工具，并进一步直接比较变化前和变化后的产品。”
对于药品，该指南还补充说，“即使所有工艺变化都在原料药的制造过程中发生，但在药品可能受到变化影响的情况下，收集原料药和药品的数据以支持可比性的确定可能是合适的。
使用强制降解研究来支持可比性的关键点是揭示释放和扩展表征方法可能无法检测到的差异的潜在能力。难以检测的差异可能是与工艺相关的杂质、与产品相关的物质或与产品相关的杂质，或者产品本身的细微构象差异。例如，宿主细胞蛋白通常通过ELISA检测，ELISA报告一个数值。众所周知，该方法并非可识别所有宿主细胞蛋白。因此，两个批次的宿主细胞蛋白量可能相同，但物种不同。如果遗漏的宿主细胞蛋白之一是蛋白酶，它会干扰长期稳定性。对于药品相关物质或药品相关杂质，导致其形成的特定修饰可能会改变其长期稳定性。例如，糖化水平的差异可能会导致聚集体数量的差异。由于重组mAb的复杂性和所用分析方法的局限性，通过释放方法以及扩展的表征方法检测构象的细微差异是具有挑战性的。然而，相对苛刻的强制降解条件可能会夸大细微的构象差异，从而通过降解产物或动力学的差异来观察。
6.2 ICH第2部分（R1）
本文件指出“如果无法获得杂质或降解产物标准品，则可以通过将含有杂质或降解产物的样品的测试结果与第二个特征明确的程序（例如药典法或其他经过验证的分析程序（独立程序））进行比较来证明特异性。在适当情况下，这应包括在相关压力条件下储存的样品：光、热、湿、酸/碱水解和氧化。本文讨论了使用降解样品来证明方法特异性的可能性，例如，方法应将杂质或降解产物与预期产物区分开来。
【NO.7】FDA指南：药物和生物制剂的分析程序和方法验证
本文件指出“如果程序是经过验证的定量分析程序，可以检测原料药和药品在储存过程中质量属性的变化，则被视为稳定性指示测试。为了证明稳定性指示试验的特异性，应进行一系列激发试验。一些挑战包括使用加标目标分析物的样品和所有已知的干扰物;经受过各种实验室应激条件的样品;以及经过老化或已在加速温度和湿度条件下储存的实际产品样品（由最终制造过程生产）。本段讨论了应力条件应用于生成目标降解产物，以测试稳定性指示方法的特异性。例如，可以从应力条件生成更高水平的聚集体，然后用于确定SEC方法的特异性。
【NO.8】EMA关于临床试验中生物研究性医药产品质量文件要求的指南
EMA的文件草案指出：“建议进行加速和应力条件研究，因为它们可能有助于了解产品的降解曲线并支持延长保质期。与其他监管指南一致，它建议使用加速和应激条件来了解降解途径。同一指南还要求在稳定性程序中包括对“分析方法的稳定性指示特性”的讨论。此类讨论应基于对降解途径的理解和使用代表性降解样品评估分析方法。
【NO.9】结论
强制降解是重组mAb治疗药物以及抗体-药物偶联物等相关产品开发过程中广泛使用的有用工具。在开发的非常早期阶段，简单的强制降解研究可以提供有关候选药物可制造性的有用信息，并有助于选择最适合向前发展的候选药物。强制降解是早期制剂开发中不可或缺的一部分，用于确定原料药和药品长期储存的适当条件。对于方法开发，建议尽早加入强制降解样品，以便于了解方法能力和限值。降解产物的产生对杂质分离和表征有很大帮助，因为这些杂质通常以如此低的水平存在于原料药中。不同降解产物的分离和表征可以为评估降解或修饰对产品功效的影响提供机会，从而定义CQA。当应用于可比性研究时，强制降解有可能揭示常规分析无法检测到的差异，从而进一步保证可比性。来自强制降解研究的数据可用于证明加工、运输和处理过程中可能发生的偏差的合理性。总体而言，强制降解提供了对分子的生化和生物物理性质的深入了解，以确保产品在能够快速临床和商业开发的时间范围内得到很好的表征。最后但并非最不重要的一点是，正如Pisupati等人最近报道的那样，强制降解也是抗体生物相似性评估的关键研究。
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