在乳制品的生产、加工、储存和运输过程中,存在两类蛋白酶:一类是乳制品自身的内源性蛋白酶,另一类则是由于微生物污染而产生的外源性蛋白酶。这些蛋白酶不仅会引发乳制品品质劣变等一系列问题,致使产品的货架期大幅缩减、口感风味严重受损,还额外增加了乳品企业在生产及加工流程中的成本投入,压缩了企业的利润空间,制约着行业经济效益的提升。研究发现,嗜冷菌所分泌的耐热蛋白酶,是影响乳制品品质安全的核心要素之一。在乳制品加工、储运这一动态且复杂的过程里,针对耐热蛋白酶活性展开实时、精准的定量监测,依旧是乳制品行业面临的主要技术壁垒与难点。北京工商大学的陈刚, 周芳芳, 申玉敏, 李世腾, 段宏和郑玲燕全面梳理了乳制品中耐热蛋白酶的相关知识体系,深入剖析了其主要来源,分析了其特殊的耐热机制以及水解蛋白质的作用模式,阐明其在乳制品环境下独特的生物学活性表现。同时,分析了传统经典检测方法在乳制品内、外源性蛋白酶检测中的技术优势以及现存局限,进而梳理了肽组学法、生物传感器等新兴检测策略。这些新兴检测方法因其独特的技术原理与检测模式,在耐热蛋白酶实时监测领域具有良好的应用前景,有望突破现有的样品复杂基质干扰、检测灵敏度与特异性难以平衡、实时性要求高等技术瓶颈。
在乳制品品质管控体系中,微生物指标的把控是核心环节[1]。原料乳的收集、储藏以及运输等关键流程通常采用冷链模式,尽管这一模式能较好地维持原料乳的新鲜度,却也为嗜冷菌营造了适宜生长的温床,使其增殖速度与代谢活动无法受到显著抑制。嗜冷菌大量分泌的耐热蛋白酶具备特殊的热稳定性,即便历经高温灭菌处理,仍可留存一定活性,进而持续水解乳品中的蛋白质成分,引发一系列诸如脂肪上浮、蛋白凝块与乳清析出、酸包和胀包现象,以及色泽、风味改变等不良的品质问题[2-3],严重影响乳制品的货架期。
乳制品中的耐热蛋白酶来源主要可归结为内源产生与外源污染两大路径。内源蛋白酶主要源自乳腺上皮细胞、血浆以及体细胞,其渗透至牛乳的具体途径主要有3种[4]:1)血浆中游离的蛋白酶能够穿越血管内皮屏障以及上皮细胞间隙,借助乳腺细胞之间的渗漏连接顺势进入乳汁体系;2)乳腺上皮细胞天然具备分泌蛋白酶的生物学功能,乳脂球膜因起源于乳腺细胞的顶膜,而乳腺细胞又与高尔基体膜存在发生学关联,故而乳脂球膜上富集大量蛋白酶;3)体细胞中的蛋白酶可通过牛乳内免疫细胞的分泌活动释放至牛乳当中。外源蛋白酶的主要生成源头是微生物分泌活动,其中嗜冷型假单胞菌属、芽孢杆菌属是较为常见的产酶微生物类别。
从乳制品稳定性及微观结构层面剖析,耐热蛋白酶会严重破坏乳品的胶体稳定性,促使乳品内部出现结块现象,直接影响其风味与品质。孟繁宇等[5]在对同一批原料乳进行不同超高温瞬时灭菌(UHT)处理时发现,牛乳中β-乳球蛋白较α-乳白蛋白热依赖性更强,UHT乳中的变性β-乳球蛋白含量更高时,会有更多的β-乳球蛋白结构发生变化并聚集,进而导致乳制品的黏度增加,最终诱发结块现象。Deeth等[6]揭示了乳品中耐热蛋白酶与UHT乳贮存过程中凝胶现象的内在关联:乳品中的酪蛋白在微观结构上呈现胶体颗粒状态,即酪蛋白胶束,其内部富含磷酸钙纳米团簇,并由磷酸化的酪蛋白紧密包裹[7]。酪蛋白胶束凭借与磷酸钙之间的离子键及疏水相互作用维系自身稳定性,同时,表面突出的κ-酪蛋白在空间位阻层面发挥稳定胶束、防止聚集的关键作用[8]。D’incecco等[9]的研究进一步表明,来自假单胞菌的耐热碱性金属酶AprX可能具有凝乳酶样活性,可以特异性地切割κ-酪蛋白的Phe105-Met106键并释放C-末端酪蛋白-巨肽,使得酪蛋白表面逐渐变得疏水,致使酪蛋白胶束稳定性急剧降低,液态乳随之产生凝胶现象,极大缩短了乳制品的保质期。
为有效控制耐热蛋白酶诱发的乳制品品质问题,精准监测乳制品中的蛋白酶活性是必需的。当前,已投入应用的检测方法涵盖分光光度法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、荧光法等[10-11]。尽管这些方法在一定程度上能够实现对乳制品中蛋白酶活力的检测,然而,受限于分析流程冗长、操作步骤繁琐复杂等固有缺陷,难以精准判断并有效预测产品货架期。伴随乳制品行业的快速发展以及消费市场对品质管控愈发严苛的诉求,急切需要开发耗时短、特异性强且灵敏度高的新型检测方法,用于乳制品中蛋白酶活性的精准测定。本研究拟全面梳理当前蛋白酶检测方法的研究现状与局限,并对其未来的发展方向进行展望,为后续乳制品中蛋白酶检测方法的优化革新、乳制品品质精细化管控提供理论参考,助力乳企紧密结合耐热蛋白酶活力监测成果与乳制品品质管控实践,全方位、高效地监控产品品质与风味。
01
乳制品中耐热蛋白酶来源及分类
1.1 乳制品中耐热蛋白酶的主要来源
1.1.1 微生物来源
芽孢杆菌是乳制品中耐热蛋白酶的重要微生物来源之一。例如,蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等。这些芽孢杆菌广泛存在于环境中,如土壤、水和空气。在原料乳的采集、运输或加工过程中,它们可能污染乳制品。芽孢杆菌的芽孢具有卓越的耐热性,能在巴氏杀菌等常见的热处理过程中存活。在适宜的条件下,芽孢萌发并大量繁殖,同时分泌耐热蛋白酶[12]。假单胞菌(Pseudomonas)也是常见的污染菌,其中荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)可在低温环境下生长并产生耐热蛋白酶[13]。在原料乳的冷藏储存过程中,荧光假单胞菌可能大量繁殖,其产生的耐热蛋白酶在后续的加工和产品储存阶段持续发挥作用,对乳品质量产生负面影响。
1.1.2 内源性来源
乳制品中内源性蛋白酶分为纤溶酶、溶酶体蛋白酶(组织蛋白酶)和凝乳蛋白酶三类,分别来自乳腺组织细胞、血浆或白细胞(图1)。纤溶酶作为乳制品中重要的蛋白水解酶,具有酸碱稳定性、热稳定性等许多特有性质[14]。当奶牛患有乳腺炎时,乳腺组织会发生一系列病理变化,而炎症反应会促使乳腺细胞分泌一些蛋白酶,其中部分蛋白酶具有耐热性,这些内源性耐热蛋白酶会随着乳汁排出混入原料乳中,从而影响乳品品质[15]。此外,奶牛在应激状态下,体内的代谢紊乱也可能导致乳汁中某些酶的含量和活性发生变化,增加耐热蛋白酶的含量。乳汁中各种成分的比例变化也影响耐热蛋白酶的产生。例如,乳汁中钙、磷等矿物质含量的异常可能激活某些潜在的蛋白酶,或者改变现有蛋白酶的稳定性,使其在热处理过程中仍能保持活性,对乳品品质和风味造成严重影响。
图1 乳品中内源性蛋白酶的来源
1.2 乳制品中耐热蛋白酶的分类及特性
1.2.1 纤溶酶
纤溶酶主要来源于血液,在正常生理状态下,少量的血液成分会进入乳腺组织并混入乳汁中,是乳品中最主要的耐热蛋白酶[16]。纤溶酶的分子质量约为83～90 kDa,在最适pH值(7.5～8.0)环境下活性较高。纤溶酶诱导的蛋白水解可对乳制品的质地和风味产生有益或有害的影响,这取决于水解程度和乳制品的类型[17]。纤溶酶容易水解β-酪蛋白和αs2-酪蛋白(β-CN和αs2-CN),同时缓慢攻击αs1-酪蛋白(αs1-CN)[18]。在某些情况下,从血液中渗入乳汁的纤溶酶原可能被激活。在这种情况下,活性纤溶酶可能会水解乳蛋白,产生多种苦味肽[19],从而造成乳制品典型的苦味,降低其风味。已发现高温短期巴氏杀菌处理对纤溶酶原激活剂抑制有显著影响,促进纤溶酶原向纤溶酶转化,导致加热后纤溶酶的活性不减反增[19];且纤溶酶耐热性极高,热杀菌后仍可保留30%～40%的酶活性[20]。
纤溶酶在包含纤溶酶原、纤溶酶原激活剂和抑制剂的综合系统中发挥作用(图2)。纤溶酶系统的组件相互作用,并与乳中的各种元素作用,以促进或阻碍乳制品中的蛋白质水解。纤溶酶主要通过乳腺细胞从血液进入乳汁。牛乳中约80%的纤溶酶活性来自纤溶酶原[21]。在鲜乳中,纤溶酶原占主导地位,其质量浓度为0.8～2.8 μg/mL,纤溶酶质量浓度为0.1～0.7 μg/mL。纤溶酶原是一种肝脏合成的含有葡萄糖的β-球蛋白,在纤溶酶原激活剂的激活下,切割分子内的Arg-Val肽链,形成两条由二硫键连接的多肽链并转化为具有活性的纤溶酶。两种类型的纤溶酶原激活剂,即组织型(t-PA)和尿激酶型(u-PA),促进纤溶酶原向纤溶酶的转化。研究表明,纤溶酶系统各组分的热稳定性不同,不同加热条件下,最终所表现出的纤溶酶活性不同,相较而言,纤溶酶、纤溶酶原及纤溶酶原激活剂的耐热性较高[22]。
图2 原料乳中纤溶酶原-纤溶酶系统
1.2.2 组织蛋白酶
组织蛋白酶D是一种天冬氨酸类酸性蛋白酶,主要来源于乳腺细胞中的溶酶体[23]。组织蛋白酶D分子质量为42～44 kDa,其活性受环境pH值影响较大,最适pH值在3.0～5.0,在酸性环境下活性较强。目前已在牛奶中鉴定出4种形式的组织蛋白酶D(酶原、中间体、单链和双链),其中酶原(非活性形式)占主导地位。组织蛋白酶D能够水解αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-酪蛋白以及α-Lg,而β-乳球蛋白对组织蛋白酶D切割具有抗性。组织蛋白酶D虽然在高温下会部分失活,但在较低的热处理强度下(低温长时间巴氏杀菌等)仍能保持活性,从而对乳中的蛋白质产生水解作用。
组织蛋白酶B是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶,可被二硫苏糖醇激活,最适pH值为6.0,在pH值高于7.0时失活,在传统的热处理过程中部分仍可保持活性[24]。组织蛋白酶B对酪蛋白具有特异性,对氨基酸Leu、Val、Gln、Pro和Ser的肽键具有明显偏好[25]。
组织蛋白酶G是中性丝氨酸蛋白酶。Considine等[26]研究了组织蛋白酶G对乳中αs1-CN和β-CN的蛋白水解特性。结果表明,组织蛋白酶G、B优先选择结合αs1-CN中的含有Glu、Ala、Phe、Arg、Leu以及β-CN中含有Ser、Thr、Leu、Phe的肽键,推测乳中固有的组织蛋白酶G、B对乳蛋白质的蛋白水解具有重要意义,但目前对于组织蛋白酶G、B的特性研究相对较少。
1.2.3 热稳定碱性蛋白酶
热稳定性碱性蛋白酶可能由微生物污染产生,也可能是乳中原有的一些酶的异构体或修饰形式。它们在碱性环境下具有较好的活性,分子质量范围因具体的酶种类而异。这类蛋白酶对热具有较高的耐受性,在一些常规的热处理过程中依然能够保持一定的活性,对乳品的品质产生潜在的影响。尤其是在一些采用较高温度短时间杀菌的工艺中,可能会引起乳蛋白的过度水解等问题。热稳定碱性蛋白酶主要作用于乳制品中的蛋白质,将蛋白质分子中的肽键断裂,产生一系列的肽段,这些肽段的产生会改变乳中的成分和性质,从而影响乳制品的稳定性和口感[27-28]。
02
耐热蛋白酶对乳制品品质的影响
耐热蛋白酶中耐高温特性使其能够在乳制品加工的高温环节持续发挥催化活性,从而对乳制品组分产生多层次影响,最终在感官体验与质构特性上呈现显著变化,如图3所示。
图3 耐热蛋白酶对乳品品质的影响
2.1 乳制品风味变化
乳品中耐热蛋白酶负责形成牛奶和奶制品的风味,主要表现为苦味、涩味、脂肪氧化味等,如乳制品中残留的蛋白酶水解乳蛋白形成苦味肽[29],这主要是由于酪蛋白分子的降解。乳品中的酪蛋白以假胶束的形式存在,这些假胶束具有复杂的结构。在牛乳中,酪蛋白含有4个亚型,依次为αs1、β、αs2和κ。每个酪蛋白亚型都有自己的作用和功能[30]。虽然κ-酪蛋白通常存在于假胶束的外部并保护其不被降解,但是β-酪蛋白大多位于假胶束的内部核心[图3(a)]。 如果假胶束不稳定,蛋白酶可以切割未受保护的酪蛋白[31]。酪蛋白裂解可以产生几个残余肽,称为γ-casein片段。这些碎片会聚集在一起,使牛奶的质地更加厚重。碎片也会影响牛奶的味道,使其变得很苦[32]。
2.2 乳制品蛋白水解
乳制品中蛋白酶的耐热性质使其经灭菌处理后仍可残留一定活性,用于水解蛋白质,但是来源于乳制品本身的内源蛋白酶和外源污染的嗜冷菌蛋白酶对乳蛋白的专一性有很大的差别[33]。有相关研究结果表明,纤溶酶主要降解β-casein、αs2-casein、αs1-casein,导致γ-casein含量上升,而嗜冷菌蛋白酶与其不同,主要降解к-casein[34]。耐热性的蛋白酶通过水解酪蛋白,破坏乳脂肪球和酪蛋白表面结构,引起脂肪与脂肪、脂肪与酪蛋白结合并聚集,形成小的薄片浮于乳的上部。
2.3 乳制品老化并形成凝胶
老化并形成凝胶是超高温灭菌乳最常见的质量缺陷现象。凝胶是一个纯粹的物理-化学聚集过程。此现象发生时,产品依然是无菌状态,但从外观上看,产品形成了类似干酪酶凝块和乳清混合物的状态,有时出现细小颗粒蛋白沉淀[35]。乳品老化并形成凝胶是超高温灭菌乳产品加工中遇到的一个主要问题,但其发生有时又不可预测,因此,引起了生产及科技人员的高度重视。
目前,大多数人认为,老化并形成凝胶的机制主要与超高温灭菌处理过程中残存的蛋白酶活性有关[36]。与凝胶化有关的蛋白酶来源有两种,其一是原料乳污染嗜冷菌微生物释放的耐热蛋白酶,在超高温热处理后,这些微生物被破坏,但是蛋白水解酶仍有部分残留;其二是乳中内源性蛋白酶,即纤溶酶系,此酶类存在于从乳房挤出的新鲜牛乳中,同时也能够在UHT处理过程中存活下来而引起产品的老化并形成凝胶[37]。嗜冷菌蛋白酶AprX优先水解酪蛋白胶粒外围的κ-酪蛋白,生成副κ-酪蛋白及一些小肽,使κ-酪蛋白无法发挥稳定蛋白质的性能,导致蛋白质聚集并在重力和Ca2+作用下逐渐沉到底部,这个过程中乳清不断排出[38][图3(b)]。AprX形成的蛋白凝块一般较硬。纤溶酶诱导的凝胶化更为复杂[图3(c)],Zhang等[39]提出了一个多步骤过程用于解释这一现象:1)渗透阶段,纤溶酶优先水解易于接近的β-和α-酪蛋白,之后纤溶酶渗透到酪蛋白胶束内部进一步水解β-和α-酪蛋白;2)松动阶段,由于胶束结构的松动,酪蛋白胶束的平均粒径略有增加;3)拆卸、重排和聚集阶段,在拆卸过程中,一些生成的两亲性和带电多肽倾向于重新排列并聚集成凝胶网络,当形成足够的聚集体时,可以观察到可见的凝胶化;4)澄清阶段,胶束颗粒和凝胶中剩余的酪蛋白持续水解,γ-酪蛋白含量升高,形成柔软而易碎的凝胶。
03
乳制品中耐热蛋白酶检测方法的研究进展
在技术持续取得突破的当下,耐热蛋白酶导致的乳制品品质问题依旧是全球性的食品难题。一些科研团队致力于精准且快速地测定乳制品中耐热蛋白酶含量的研究,希望通过相关技术的突破来把控乳品品质、维系消费者健康,助力行业稳健发展。在基础研究方面,欧美等乳业发达地区的科研团队成果显著,在耐热蛋白酶生成机制的解析上取得诸多突破性进展。借助前沿微生物学技术,精准甄别出假单胞菌属这类在乳制品环境中极为关键的嗜冷菌种类[40],为后续靶向性检测方案的设计夯实了理论根基。在应用技术研发方面,国外始终占据革新前沿,率先进行微滴式数字PCR(ddPCR)[41]、新型生物传感器[42]等前沿检测技术的探索。凭借先进技术理念与工程转化能力,部分先进成果已完成产业化落地,广泛嵌入大型乳制品企业的自动化生产线,实现了对生产流程中耐热蛋白酶含量的实时、精准监测。
尽管国内研究起步相对较晚,但近年来伴随本土乳业市场规模的指数级扩张,行业发展势能强劲,国内高校、科研院所与乳制品企业迅速形成产学研联动合力,正全力攻克乳中耐热蛋白酶检测难题。秉持开放、借鉴的理念,国内研究团队积极汲取国外先进技术经验,同时紧密贴合我国乳业发展实情,因地制宜开展创新性研究。我国奶源地理分布跨度广袤,乳企加工工艺多元繁杂,立足于此独特产业背景,研究人员针对性地改良既有检测手段,如优化环介导等温扩增技术(LAMP),巧妙调整反应体系与引物设计,使其契合奶源地现场快速筛查需求,显著提升检测时效性[43-44]。尤为值得一提的是,国内学界与业界正全力投身新型纳米材料耦合检测技术研发,旨在突破国外技术封锁,打造契合本土需求的自主化检测技术体系,借此稳步提升我国乳制品检测技术的自主可控水平,为行业可持续发展注入内生动力。
因此,依据嗜冷菌在乳中的生长特点,研究者们从两方面展开了检测工作。一方面是针对嗜冷菌菌落,运用传统平板培养法和现代分子生物技术,在门、属、种等分类层次上对嗜冷菌进行分离与鉴定,以此来明确乳中嗜冷菌的种属特性及分布情况[45-46];另一方面,鉴于嗜冷菌产生的耐热酶会对乳中的蛋白质和脂肪造成损害[47],部分研究者开发了基于酶的检测方法,主要包括酶联免疫吸附检验(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)[48]、液相色谱-串联质谱(liquid chromatograph mass spectrometer/mass spectrometer,LC-MS/MS)技术[49]等。不同的耐热蛋白酶检测方法已被不断开发(表1),如酶联免疫吸附测定(ELISA)、生物传感器、荧光、肽组学等方法,为乳中耐热蛋白酶的检测提供了一定的技术支持。
表1 耐热蛋白酶检测方法的比较
3.1 传统检测方法
3.1.1 平板计数法
因乳品中大多数嗜冷细菌在冷链运输过程中会随温度(2～30 ℃)升高而变得活跃,从而分泌热稳定的胞外蛋白酶,对乳品造成不良影响。研究者们通过检测乳品中嗜冷菌来间接评估其产胞外耐热蛋白酶的活性。平板计数法作为检测乳品中嗜冷菌的传统手段,长期以来在微生物检测领域占据一席之地,国际乳业联合会(IDF)所制定的相关标准方法更是行业通用的参照基准,其中,IDF Standard 101A以及IDF Standard 132A具有代表性。IDF Standard 101A明确规定了具体的操作流程,将适量原料乳在6.5 ℃培养10 d,在这一培养周期里原料乳中的嗜冷菌得以缓慢增殖;待培养期满后,借助平板计数技术,对生长形成的菌落数目进行统计,以此来推算原料乳中嗜冷菌的初始含量。但在实际检测中该法虽能直观反映嗜冷菌数量,却存在显著弊端:试验周期冗长,耗时费力,难以契合快速生产节奏与即时质量把控需求。另一种操作范式IDF Standard 132A,是将原料乳放置在21 ℃的环境里培养25 h,随后同样运用平板计数法统计菌落。相对而言,该方法显著缩短了检测时长,但在实际应用时却暴露出结果精准度欠佳的弊端。采用IDF Standard 132A进行嗜冷菌检测,与采用高精度基因测序法检测的结果进行比对后发现,平板计数法所得结果偏差率高达20%左右。这是由于21 ℃的培养环境虽加快了检测进程,却也为杂菌滋生创造了契机,干扰了嗜冷菌菌落的准确识别与计数,进而致使检测结果失准;同时,两种方法均不能满足基层在线监测和现场检测的要求。因此,有必要挖掘简便快速、灵敏准确的乳品中嗜冷菌检测方法。
3.1.2 酶活性检测法
酶活性检测法通过检测蛋白酶对特定底物的水解活性来间接测定耐热蛋白酶含量。该方法基于蛋白酶的水解功能特性,借助其对特定底物的催化水解反应进程,实现对耐热蛋白酶含量的精准推算[56]。酶与底物之间存在高度特异性的相互作用,耐热蛋白酶作为一类特殊的水解酶,能够作用于精心挑选的特定底物分子,促使底物化学键断裂,发生水解反应;通过监测这一水解反应的程度与速率,便可以间接反映出体系中耐热蛋白酶的实际含量。
福林酚法是当前蛋白酶活性检测实践中广泛运用的方法之一[50],其核心原理在于,当耐热蛋白酶作用于相应底物时,会催化底物分子降解,产生含有酚羟基的氨基酸残基或肽段片段。这些降解产物中的酚羟基,在碱性环境下具备特殊的化学活性,能够与福林酚试剂发生特异性显色反应。福林酚试剂在碱性条件以及强氧化剂作用下,会与含酚羟基的水解产物发生氧化还原及络合反应,进而生成结构复杂、呈蓝色的复合物,通过比色法测定复合物的吸光度来计算蛋白酶的活性。杨旭等[51]通过福林酚法、邻苯二甲醛衍生比色法和甲醛法对牛奶中蛋白酶活力测定的统计学分析和回收试验结果的比较,得出结论:3种方法均可测定牛奶中蛋白酶活力,其中福林酚法操作简便,但精确度和准确度较低,结果重现性不好,适合于牛奶中蛋白酶活力的粗略性和比较性测定。周欢等[57]通过优化福林酚法测定牛奶中蛋白酶活力的实验条件,解决了检测结果重复性差、检测效率不高等问题。但该方法无法区分不同来源的蛋白酶,且易受样品中其他成分的干扰。
3.1.3 免疫检测法
免疫检测法基于抗原与抗体间特异性结合的免疫学原理,实现对耐热蛋白酶的精准检测,其中酶联免疫吸附试验(ELISA)是最为常用的技术手段之一。ELISA法凭借其出众的灵敏度与高度的特异性,在蛋白质检测领域占据重要地位。在乳制品检测中,嗜冷菌蛋白酶因优先水解κ-酪蛋白(κ-CN)的特性而受到关注。Dupont等[58]巧妙利用这一特性,开发了一种靶向Phe105-Met106键水解性能的ELISA检测方法。该方法主要在于制备针对Phe105-Met106键的单克隆抗体,经与载体蛋白偶联、免疫原处理后,抗体能够精准识别完整肽键结构的κ-CN。 一旦目标肽键被蛋白酶裂解,抗体与底物的结合能力随即丧失,以此实现对Phe105-Met106键处完整κ-CN的定量分析。相较于传统ELISA法,此改良技术大幅提升检测效率,能够在3 h内迅速完成20余个样品的检测分析,且样品回收率稳定维持在97.5%～105.5%,充分提高了其检测准确性与高效性。Volk等[10]则聚焦于牛奶中热稳定假单胞菌的金属蛋白酶(AprX),创新性地建立一套针对AprX的ELISA检测体系。鉴于牛奶样本基质复杂,富含大量乳蛋白,易对检测系统造成干扰,研究团队采取两步法对被AprX污染的牛奶样本进行精细前处理,成功分离、纯化AprX,并以此为抗原制备了特异性抗体,有效规避了牛奶蛋白引发的非特异性吸附与干扰,确保检测结果的真实性和可靠性。尽管ELISA方法在检测乳制品蛋白酶活性层面展现出一定效能,但仍存在局限性,如检测前需耗费大量资源制备特异性抗体,致使检测成本上升,且操作流程繁杂,涉及样本孵育、洗涤、显色等诸多精细步骤,致使分析周期长;此外,由于抗体识别位点的特异性并非绝对精准,面对结构相似的蛋白酶时,免疫检测法易出现交叉反应,进而引发检测结果的假阳性,干扰实际判断;同时样本通量低的弊端,难以契合高效生产需求。
3.2 现代检测方法
随着乳制品加工业对耐热蛋白酶检测的灵敏度、特异性及高通量需求的日益严苛,传统分析方法因受限于复杂基质干扰、检测通量低及实时性不足等瓶颈,难以满足工业化生产的全链条质控要求。近年来,表面增强拉曼技术(SERS)、基于多组学联用与纳米传感技术等的创新检测体系迅速发展,通过分子识别机制与信号放大策略的整合,为乳中蛋白酶活性检测提供了新策略(图4)。
图4 4种新型耐热蛋白酶检测方法
3.2.1 表面增强拉曼技术
表面增强拉曼技术作为一类快速分析技术,凭借其独特的分子特异性识别能力,在化学物质定量检测领域备受关注[59]。Yazgan等[54]创新性地将SERS技术应用于乳品中纤溶酶活性检测,开辟了全新的检测范式。首先,精心筛选能够特异性识别纤溶酶的不同肽序列,以此为基石制备SERS底物;经系统实验验证,成功获取了SERS强度变化与纤溶酶浓度间的线性关系,为乳品中纤溶酶活性的精准定量检测奠定了坚实基础[图4(a)]。SERS技术在后续乳制品添加回收实验中兼具快速、灵敏特质,契合现场快速检测乳制品中纤溶酶的实际需求。鉴于SERS技术对底物修饰的高度适配性,有望突破传统高通量分析的技术壁垒,实现蛋白酶的高通量并行检测,更大地提升检测效率。
3.2.2 肽组学检测法
乳制品蕴含丰富多样的蛋白质,其一级序列构成了肽的关键来源。肽段生成机制主要源于蛋白酶的水解作用以及热裂解效应,基于此,Leite等[60]率先开展了不同热处理条件对牛、羊奶肽谱及蛋白酶活性影响的专项探究。研究团队巧妙运用EnzymePredictor软件,深度剖析热处理衍生的肽序列信息[图4(b)],以精准预测参与水解肽键的蛋白酶种类,并同步测定蛋白酶活性,从而揭示热处理、肽谱动态与蛋白酶活性三者间的内在关联。Baum等[61]则聚焦于奶中内源性肽谱分析,经系统性研究发现,诸多内源性肽的形成机制与纤溶酶、组织蛋白酶D、B和G的活性密切相关。为直观呈现蛋白水解程度,该团队创新性引入肽段分布热图,热图中颜色的急剧变化精准指示特定肽段存在丰富切割位点,抑或单一裂解位点遭受多次切割的情形;通过统计含有特定氨基酸的肽段数量,巧妙实现对酶活性的相对定量,为蛋白酶活性评估提供量化依据。Dallas等[62]则针对泌乳高峰期的乳制品肽组学展开深度剖析,成功印证前人研究结果,即肽段来源具备高度一致性。酶切分析进一步揭示,多数乳品样品中的蛋白质遭到纤溶酶、组织蛋白酶B和D,以及弹性蛋白酶等的降解;基于切割位点的累计强度量化指标,成功构建起蛋白酶活力的有效推测模型,显示出肽组学检测法在乳制品蛋白酶活性检测领域的应用潜力。
3.2.3 生物传感器检测法
生物传感器使用抗体、适配体、核酸、酶等作为生物识别元件,通过检测系统将识别结果转换为可视的光信号、电信号等,可实现灵敏、快速、成本低廉的现场检测。声学生物传感方法证明了其检测和表征蛋白酶活性的潜在能力,特别是对于检测牛奶等不透明液体中的蛋白酶,该方法无须任何光学活性或分子标记。在这种情况下,蛋白酶裂解的底物,如短肽或β-酪蛋白,被固定在压电换能器上,基板的裂解导致声学传感器的质量损失和共振频率的增加。这种类型的传感器基于声波传播原理,通过检测表面质量变化或机械振动特性来感知生物分子相互作用,例如厚度剪切模式传感器和电磁压电声学传感器等。Poturnayova等[63]首次报道了通过厚度剪切模式声学方法检测纤溶酶[图4(c)],检测限为0.65 nmol/L(肽底物)。厚度剪切模式声学传感器的生物识别元件由固定在压电石英晶体电极上的纤溶酶特异性肽底物组成,在与纤溶酶发生酶促反应后,肽的一小段会被裂解,导致压电晶体的共振频率增加。Poturnayova等[64]在厚度剪切模式方法上进行改进,开发了用于纤溶酶检测的石英晶体微天平生物传感器,当使用疏水表面制备β-酪蛋白层时,获得了更灵敏的响应,检测限为0.17 nmol/L(β-酪蛋白)。Románszki等[55]在疏水表面的最佳配置(β-酪蛋白的固定化)下,使用电磁压电声学传感器方法大大提高了纤溶酶检测的灵敏度,因为β-酪蛋白的亲水基团暴露在水环境中,因此更容易被纤溶酶吸收,检测限为32 pmol/L。在新型的超声传感技术中,高分辨率超声光谱表现出优于光学方法和传统超声技术的特性,特别是用于实时无损精确监测牛奶蛋白酶对牛奶蛋白的水解反应[65]。高分辨率超声光谱检测蛋白酶活性是基于水解反应引起混合物可压缩性和密度的变化影响其超声波特性,从而可实时监测蛋白质的裂解,高分辨率超声光谱和表面声学技术灵敏度相当,可检测在亚纳米范围内的牛奶蛋白酶活性。
3.2.4 荧光共振能量转移检测法
荧光共振能量转移技术的特征是偶极-偶极相互作用,促进能量从激发态供体荧光团(D)转移到基态受体(A),除了供体和受体位于近距离的条件之外,供体的发射光谱必须与受体的吸收光谱重叠。Li等[66]使用上转换纳米颗粒作为能量供体,Cy5作为能量受体,用于体外和体内组织蛋白酶B的活性检测。当组织蛋白酶B的Cy5修饰肽底物在上转换纳米颗粒表面共价连接时,上转换纳米颗粒和Cy5修饰肽底物之间的荧光共振能量转移导致上转换纳米颗粒的红色上转换发光信号强度降低。在组织蛋白酶B存在下,Cy5修饰肽底物可以通过组织蛋白酶B裂解肽Cy5从上转换纳米颗粒中释放出来,荧光共振能量转移过程受到影响。肽的裂解导致荧光降低,为组织蛋白酶B提供了检测平台。基于这一原理,Dacres等[67]使用AprX酶水解特定肽底物后[图4(d)],将生物发光共振能量转移供体肾荧光素酶(RLuc2)与受体绿色荧光蛋白(GFP2)分离,从而终止能量转移。该检测方法灵敏度较高、速度快,适用于测量原料乳和加工乳中的细菌蛋白酶活性,可为减轻热稳定细菌蛋白酶的影响和最大限度地延长乳制品保质期提供技术支持。
基于共轭聚合物的超分子复合物也被报道用于检测蛋白酶。共轭聚电解质由于其离域π电子主链具有独特的特性,例如强荧光、良好的量子产率和对淬灭剂的灵敏响应,可作为检测蛋白酶的工具。An等[68]利用呈现荧光的丝氨酸导电聚合物-聚噻吩作为底物,Cu2+与丝氨酸相互作用使得荧光淬灭。底物中添加的牛血清白蛋白在蛋白酶的作用下,被水解成各种氨基酸或多肽,螯合Cu2+的能力更强。Cu2+从聚噻吩中释放,聚噻吩荧光重现,指示蛋白酶的活性。Wang等[69]利用银纳米结构的金属增强荧光效应,开发了一种基于共轭聚电解质-银纳米棱镜对的光学纳米尺系统,用于无标记蛋白质检测。抗体-抗原相互作用诱导金属-荧光团距离的变化,随后是偶联聚电解质的荧光信号响应。该系统可用于灵敏和选择性地检测靶抗原。这些新型的蛋白酶检测方法为实现乳制品中耐热蛋白酶活性实时监测提供了可能。
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结论与展望
原料乳中的嗜冷菌所分泌的蛋白酶,能够引发脂肪上浮、蛋白凝块、乳清析出、酸包与胀包,以及乳品色泽与风味异变等一系列品质劣变现象,这些问题不仅严重损害了乳制品的固有品质,也对其市场接受度构成显著影响。嗜冷菌分泌的蛋白酶是鲜奶遭受污染的直观指标之一,研发高效、精准的耐热蛋白酶快速检测技术,对于强化乳品质量监管、维护产业良性发展具有一定的意义。
目前,耐热蛋白酶检测技术大多尚处于实验室探索阶段,尽管生物传感器等新型检测手段展现出一定的应用潜力,但距离成熟的商业推广仍存在较大差距。在乳制品加工领域,嗜冷菌含量虽已被纳入质量控制标准体系,但其代谢所产耐热蛋白酶的酶活力在常规灭菌流程后仍有部分残留,致使细菌活菌数量与酶活力水平之间难以建立直接关联,无法精准映射产品真实质量状态。此外,不同菌株的蛋白酶生成能力及酶稳定性各异,在复杂的乳制品生产环境中,各菌株的生存适应性与产酶特性不尽相同,并非所有菌株都对产品质量造成同等程度的负面影响。因此,深入开展细菌及其代谢耐热蛋白酶的精细化鉴定工作,精准甄别高风险菌株及其酶学特征也尤为重要。
综合国内外乳品蛋白酶活力测定技术的研究趋势,现用于检测乳制品酶活性的方法普遍存在检测流程冗长、操作步骤繁琐等弊端,且极易受到乳制品复杂基质成分的干扰,难以满足快速、准确、可靠的检测需求。因此,亟须突破现有技术瓶颈,聚焦攻克基质干扰问题,构建兼具高效性、精准性与便捷性的耐热蛋白酶活性检测新技术,为我国乳品产业稳健前行筑牢技术根基,推动行业迈向高质量发展轨道。
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参考文献：略
引用格式：陈刚,周芳芳,申玉敏,等.乳制品中耐热蛋白酶及其检测方法研究进展[J]. 食品科学技术学报,2025,43(3):1-13. CHEN Gang, ZHOU Fangfang, SHEN Yumin, et al. Research progress on heat-resistance protease in dairy products and its detection methods[J]. Journal of Food Science and Technology, 2025,43(3):1-13.
基金项目： 国家自然科学基金资助项目(32230083, 32302235)。
Foundation: National Natural Science Foundation of China (32230083, 32302235).
制作：张羽
编辑：张逸群、李宁
审核：叶红波