根皮素通过抑制PDK1-p-PDHA1轴影响谷氨酰胺代谢介导的前列腺癌研究

前列腺癌是男性中较为常见的一种癌症，其发病率随着年龄的增长而显著上升，近年来，随着对前列腺癌研究的深入，发现前列腺癌不仅仅是一种简单的细胞增殖失控疾病，而是一种复杂的代谢异常疾病^[1-2]。例如，谷氨酰胺（glutamine，Gln）代谢在前列腺癌的发展进程中扮演着关键角色，通过调控Gln代谢途径，可能有效影响癌细胞的能量供应及存活能力^[3]。根皮素作为一种具有抗癌活性的类黄酮化合物，通过增加活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的产生、抑制抗氧化系统功能、影响Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路等机制，有效抑制了前列腺癌细胞的增殖、迁移和集落形成^[4]。然而，根皮素是否通过Gln代谢途径抑制前列腺癌仍未阐明。

研究表明，丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）在多种癌症中高表达，并且这种高表达能够促进丙酮酸脱氢酶E1亚基α 1（pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1，PDHA1）转变为磷酸化-PDHA1（phosphorylation PDHA1，p-PDHA1），进而导致癌细胞的代谢重编程，促进癌细胞的生存和转移^[5]。此外，Gln分解不仅是肿瘤生长的主要能量来源之一，也是肿瘤生物合成的重要组成部分，在食管鳞状细胞癌中，谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）与PDK1相互作用提高p-PDHA1水平，并灭活丙酮酸脱氢酶，进而加速癌症细胞的有氧糖酵解^[6]。本研究通过生物信息与网络药理学分析发现PDK1是根皮素、前列腺癌与Gln代谢相关基因的靶点交集之一，通过体内、外实验探究根皮素能否通过抑制PDK1-p-PDHA1信号通路影响Gln代谢介导的前列腺癌进展，为前列腺癌的分子机制研究及治疗方法提供实验基础。

1  材料

1.1  细胞株与动物

人前列腺癌细胞PC-3、DU145、LNCaP和人前列腺细胞RWPE-1（批号SCSP-532、SCSP-5024、SCSP-5021）由中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库提供。

SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，4～5周龄、体质量（18±2）g，购自天津科德生物科技有限公司，许可号SCXK（津滨）2021-0001），动物饲养于SPF级清洁环境中，温度22～26 ℃，相对湿度40%～60%，饲养期间动物自由获取食物和水。本研究动物实验经天津市南开医院伦理委员会批准，批准号为NKYY-DWLL-2023-087。

1.2  药品与试剂

根皮素对照品（质量分数＞99%，批号60-82-2）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，质量分数99.98%，批号67-68-5）购自美国MedChemexpress生物科技公司；F-12K培养基（批号PM150910B）、MEM培养基（批号PM150443）、RPMI Medium 1640培养基（批号PM150145）、胎牛血清（批号164210）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；脂质体Lipo-fectamine 3000转染试剂盒（批号BL632A）购自兰杰柯科技有限公司；PDK1过表达载体（pcDNA3.1-

PDK1，F：CGCGGATCCATGAGGCTGGCGCGGCT-

GCTT，R：CCGGAATTCCTAGGCACTGCGGAACG-

TCGT）及其对应的空载体对照（pcDNA3.1）、PDK1

敲减载体（KD-PDK1，ATCAGTGAATGCTTGTGA-

AAAGA）及其对照（KD-Control，UUCUCCGAA-

CGUGUCACGUTT）、PDHA1过表达载体（pcDNA3.1-PDHA1，F：CGCGGATCCATGAGGA-

AGATGCTCGCCGCC，R：CCGGAATTCTTAAC-

TGACTGACTTAAACTT）及其对照（pcDNA3.1）由北京合生生物公司设计并合成；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8，批号PF00004）购自武汉三鹰生物技术有限公司；基质胶（批号356234）购自北京博蕾德生物科技有限公司；Gln试剂盒（批号BC5300）、谷氨酸试剂盒（批号BC1585）、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）含量检测试剂盒（批号BC0305）购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白测定试剂盒（批号P0010）、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE，批号P0012A）、聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF，批号FFP19）、RIPA裂解液（批号P0013B）、TUNEL试剂盒（批号C1089）购自上海碧云天生物技术股份有限公司；PDK1抗体（批号ab110025）、p-PDHA1抗体（批号ab177461）、ki67抗体（批号ab16667）、GLS抗体（批号ab317032）、HRP标记的山羊抗兔二抗（批号ab6721）购自英国Abcam公司。

1.3 仪器

Varioskan ALF型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；PowerPac HC型电泳仪（美国 BioRad公司）；BX43型光学显微镜（日本Olympus公司）；Microfuge 20/20R型离心机（美国Beckman Coulter公司）。

2  方法

2.1  生物信息学分析

以校正后P＜0.05、|log₂FC|＞1从NCBI网站中的GEO DataSets（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中筛选出基因芯片GSE46602、GSE55945、GSE70768中的前列腺癌差异表达基因。利用Swiss和Prediction数据库预测根皮素的相关靶点。从MSigDB数据库和已发表的研究^[7]中收集与Gln代谢相关的基因。利用Venn图对根皮素的分子靶点、前列腺癌差异表达基因以及Gln代谢相关基因进行交集分析。通过PubChem数据库检索并下载根皮素化合物的分子结构，通过PDB数据库分别检索间质表皮转化因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）基因和PDK1的三维结构。在PyMOL 2.3.0软件中打开检索到的“PDB”文件，进行结构处理，包括去除非关键蛋白链、删除水分子及其他溶剂分子等。在“AutoDock”中设置对接实验，定义网格盒子以覆盖可能的结合位点，调整对接参数如算法类型、搜索精度等，探索根皮素与MET、PDK1之间的最佳结合模式及结合能。

2.2  细胞培养与分组

PC-3细胞培养在添加10%胎牛血清的F-12K培养基中，DU-145细胞与LNCaP细胞分别培养在含有10%胎牛血清、1% Gln、1% 100 mol/L丙酮酸钠溶液的MEM培养基和RPMI Medium 1640培养基中，RWPE-1细胞培养在含有15%胎牛血清和10% DMSO的完全培养液中。所有细胞于37 ℃、5% CO₂的环境中培养。

将处于对数生长期的各细胞按5×10⁵个/孔接种于96孔板，将细胞分为对照组（0.1% DMSO），根皮素低、中、高剂量（25、50、100 μmol/L）组^[8]，顺铂（0.03 mmol/L）^[9]组，Gln（2 mmol/L）组^[3]，Gln（2 mmol/L）＋根皮素（100 μmol/L）组。当细胞完全贴壁后，去除原有培养基，分别向细胞中加入相应药物，继续培养12 h。

将处于对数生长期的PC-3细胞按2×10⁵个/孔接种于96孔板。待细胞生长密度至60%～70%，将细胞分为空载体对照（pcDNA3.1）组、PDK1过表达载体（pcDNA3.1-PDK1）组、PDK1敲减载体（KD-PDK1）组及其对照（KD-Control）组、PDHA1过表达载体（pcDNA3.1-PDHA1）组、KD-PDK1＋pcDNA3.1组、KD-PDK1＋pcDNA3.1-PDHA1组、根皮素（100μmol/L）＋pcDNA3.1组以及根皮素＋pcDNA3.1-PDK1组。根据Lipofectamine 3000试剂盒说明书进行基因转染操作，各组分别转染相应载体。

2.3 CCK-8检测细胞增殖活力

将各组PC-3细胞以2×10⁵个/孔接种于96孔板，于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养12 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养1 h。利用酶标仪在450 nm波长下测定每孔的吸光度（A）值并计算细胞活力。

细胞活力＝(A_给药－A_空白)/(A_对照－A_空白)

2.4 Transwell检测细胞侵袭

将处于对数生长期的PC-3细胞以1×10⁵个/孔接种于包被有基质胶的Transwell小室的上室，同时添加含有1%胎牛血清的1640/F12培养液；下室添加含有15%胎牛血清的1640/F12培养液，12 h后，利用棉签移除上室顶部未发生侵袭的细胞，对已成功穿透基质胶并附着于上室底部的细胞进行固定和染色。于显微镜下拍摄染色细胞，随机选取3个视野进行计数。

2.5  TUNEL检测细胞凋亡

每组取1×10⁵个细胞，各组样品细胞经过PBS洗涤2次后，于4%多聚甲醛中4 ℃固定30 min，再次使用PBS洗涤2次，用含0.3% Triton X-100的PBS溶液室温处理5 min，PBS洗涤细胞2次。按照试剂盒说明书配制TUNEL反应混合液，每组细胞培养板中加入50 μL的TUNEL反应液，于37 ℃避光孵育60 min。PBS冲洗3次后，用抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜在特定激发波长（550 nm）和发射波长（570 nm）下观察凋亡细胞的红色荧光标记并记录细胞凋亡数。

2.6 细胞Gln消耗水平、谷氨酸水平及ATP水平测定

分别取5×10⁶个细胞，按照Gln、谷氨酸、ATP含量检测试剂盒说明书对样本进行处理，测定各组细胞Gln消耗水平、谷氨酸水平及ATP水平。

2.7  Western blotting法测定相关蛋白表达水平

将各组细胞以每孔5×10⁵个/孔接种于6孔板中，使用预冷的PBS洗涤细胞2次后，每孔加入120μL含有RIPA的预冷PMSF细胞裂解液，将其转移至1.5 mL离心管中，冰上静置30 min，每10分钟混匀1次，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用BCA法测定各样品中的总蛋白浓度。取20 μg的总蛋白样品，与上样缓冲液混合后，进行加热变性处理，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，用脱脂奶粉封闭1 h后，洗膜3次，分别加入GLS1（1∶1 000）、PDK1（1∶1 000）、p-PDHA1（1∶2 000）一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜3次后，二抗（1∶2 000）室温孵育1 h。用ECL化学发光系统避光显影，利用Image-J软件对条带计算条带的灰度值。

2.8  动物分组、造模及给药

取处于对数生长期的PC-3细胞制成1×10⁷个/μL的细胞悬液。在无菌条件下，向每只小鼠右侧腋背部sc 0.15 mL细胞悬液，7 d 后肿瘤体积增长至约30 mm³，将30只C57BL/6小鼠随机分为模型组、DMSO组、顺铂（2 mg/kg）组和根皮素低、高剂量（25、50 mg/kg）组^[10]。使用DMSO将根皮素溶解，根皮素低、高剂量组ip相应根皮素DMSO溶液（0.2 mL），DMSO组ig等体积DMSO，顺铂组ip 0.2 mL顺铂溶液^[11]，每2天1次，持续6周。实验期间，每周同一时间使用游标卡尺精确测量肿瘤的长径（a）和横径（b），计算肿瘤体积。实验结束后，对小鼠实施安乐死，立即剥离肿瘤组织，称定肿瘤质量。

肿瘤体积＝ab²/2。

2.9  肿瘤组织Gln消耗水平、谷氨酸水平、ATP水平测定

取小鼠肿瘤组织匀浆，12 000×g离心5 min后，按照试剂盒说明书测定肿瘤组织Gln消耗水平、谷氨酸水平、ATP水平。

2.10  免疫组织化学法相关指标检测

将肿瘤组织固定于10%中性福尔马林，进行常规的石蜡包埋与连续切片，切片常规脱蜡复水、微波抗原修复后加入3% BSA封闭后，分别加入GLS1（1∶500）、ki67（1∶200）、PDK1（1∶200）、p-PDHA1（1∶250）一抗，4 ℃孵育过夜。洗涤后加入二抗室温孵育。DAB显色、苏木素复染、二甲苯透明后封片。于显微镜下观察染色情况并采集图像，采用Image-Pro plus软件分析各组肿瘤组织中GLS1、ki67、PDK1、p-PDHA1的平均光密度值^[12]。

平均光密度值＝积分光密度值/区域面积

2.11  统计学分析

所得数据以 表示，采用GraphPad Prism 9.5软件进行统计分析。两组间比较选用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析。

3  结果

3.1 对前列腺癌细胞的增殖、侵袭及凋亡的影响

与对照组比较，顺铂及不同剂量根皮素干预对人前列腺细胞RWPE-1增殖活力无明显影响，但能够明显抑制各前列腺癌细胞增殖（图1-A）。初步实验结果显示100 μmol/L的根皮素对PC-3细胞增殖影响最明显，因此选用100 μmol/L根皮素及PC-3细胞进行后续实验，结果表明，与对照组比较，根皮素组细胞侵袭能力降低（P＜0.001）、凋亡能力增加（P＜0.01），且呈剂量相关性（图1-B、C）。

3.2 对PC-3细胞生物学行为的影响

如图2所示，与对照组比较，根皮素组PC-3细胞中Gln消耗水平、谷氨酸与ATP水平下降（P＜0.05、0.01），GLS1蛋白表达水平降低（P＜0.05），细胞增殖与侵袭能力降低（P＜0.05、0.01），细胞凋亡数目增加（P＜0.001）；Gln组Gln消耗水平、谷氨酸和ATP水平增加（P＜0.001），GLS1蛋白表达表达水平增加（P＜0.001），细胞增殖与侵袭能力提升（P＜0.01、0.001），凋亡减少（P＜0.05），通过联合根皮素处理后则逆转了这一结果（P＜0.05、0.01、0.001）。

3.3 根皮素抑制PDK1在PC-3细胞中的高表达

GSE46602、GSE55945、GSE70768 3个基因芯片中共得到1 688个前列腺癌差异表达基因，Swiss和Prediction数据库预测得到437个根皮素相关靶点，MSigDB网站与已发表的文献^[7]共得到180个Gln代谢相关基因，Venn图对三者取交集共得到12个交集靶点（图3-A）。分子对接结果显示根皮素和MET的对接分数为−7.3 kcal/mol（1 kcal/mol＝4.182 kJ/mol），根皮素和PDK1的对接分数为−8.0 kcal/mol，表明根皮素和PDK1之间的结合能更强（图3-B）。Western blotting结果如图3-C所示，PC-3细胞中的PDK1蛋白表达显著高于RWPE-1细胞（P＜0.001），而根皮素能够显著抑制PC-3细胞中的PDK1蛋白表达（P＜0.001）。

3.4  过表达PDK1逆转根皮素对PC-3细胞生物学行为及Gln代谢的影响

如图4-A～H所示，与对照组比较，根皮素组PDK1蛋白表达显著降低（P＜0.001），细胞增殖与侵袭能力下降（P＜0.01、0.001），凋亡增加（P＜0.001），Gln消耗水平、谷氨酸和ATP水平降低（P＜0.01、0.001），GLS1蛋白表达水平下调（P＜0.001）；与pcDNA3.1组比较，根皮素＋pcDNA3.1组细胞中PDK1蛋白表达升高（P＜0.001），细胞增殖与侵袭能力增加（P＜0.01、0.001），凋亡减少（P＜0.001），Gln消耗水平、谷氨酸和ATP水平升高（P＜0.01、0.001），GLS1蛋白表达水平减弱（P＜0.001）；与根皮素＋pcDNA3.1组比较，根皮素＋pcDNA3.1-PDK1组PC-3细胞中PDK1蛋白表达水平升高（P＜0.01），细胞增殖与侵袭能力上升（P＜0.05、0.001），凋亡减少（P＜0.05），Gln消耗水平、谷氨酸和ATP水平上调（P＜0.05），GLS1蛋白表达水平下降（P＜0.001）。

3.5  上调PDHA1逆转敲减PDK1对PC-3细胞生物学行为及Gln代谢的影响

与对照组比较，敲减PC-3细胞中的PDK1后，p-PDHA1蛋白表达被抑制（P＜0.001），细胞增殖与侵袭能力降低（P＜0.001），凋亡增加（P＜0.001），Gln消耗水平、谷氨酸和ATP水平下降（P＜0.001），GLS1蛋白表达水平降低（P＜0.001）；与KD-PDK1＋pcDNA3.1组比较，KD-PDK1＋pcDNA3.1-PDHA1组p-PDHA1表达增强（P＜0.001），细胞增殖与侵袭能力提升（P＜0.05、0.01），凋亡减少（P＜0.05），Gln消耗水平、谷氨酸和ATP水平上调（P＜0.01，0.001），GLS1蛋白表达水平增加（图5-A～H，P＜0.01）。

3.6 对小鼠移植瘤的影响

各组小鼠肿瘤组织见图6-A，与模型组比较，DMSO干预未对肿瘤组织生长产生明显影响。如图6-B～C所示，与DMSO组比较，顺铂组、根皮素25 mg/kg组与根皮素50 mg/kg组小鼠肿瘤体积与肿瘤质量显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。如图6-D～F所示，肿瘤组织中Gln消耗水平、谷氨酸与ATP水平降低（P＜0.05、0.001）；如图6-G所示，与DMSO组比较，GLS1、ki67、PDK1、p-PDHA1表达均显著降低（P＜0.001）。

4  讨论

前列腺癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围内呈现不断上升的趋势，对老年男性患者的健康构成了严重威胁。前列腺癌的隐匿性和晚期发现的特点使得许多患者在确诊时已处于局部晚期或转移性阶段，这进一步增加了治疗的难度和复杂性^[13]。中医药在治疗前列腺癌中具有独特的优势，其多成分、多靶点、多途径的综合调节作用以及丰富的药物资源为前列腺癌的治疗提供了新的选择^[14]。研究表明，根皮素通过诱导前列腺癌细胞的凋亡和周期阻滞，显示出较强的抗肿瘤活性，且对正常细胞毒性较小^[10]。本研究通过体内外实验证实根皮素具有作为前列腺癌治疗药物的潜力，且抑制PDK1-p-PDHA1信号通路及Gln代谢可能是其作用机制。

Gln是癌细胞进行能量代谢和生物合成的重要底物，有研究指出沉默信息调节因子4（silentinformation regulator 4，SIRT4）通过抑制Gln代谢能够抑制前列腺癌细胞的迁移、侵袭能力和增殖，表明Gln代谢的活跃性对于癌细胞的这些恶性行为具有促进作用^[15]。谷氨酸是Gln代谢的产物之一，其水平的变化可以反映Gln代谢的活跃程度，GLS1是Gln代谢的关键酶，负责将Gln转化为谷氨酸，进而进入三羧酸循环产生ATP，通过调节这些代谢相关指标，可以影响癌细胞的代谢状态和生长能力，为癌症治疗开辟新的途径^[16]。本研究发现根皮素作为一种天然化合物，其抗癌作用不仅限于直接抑制癌细胞增殖和促进凋亡，还深入到细胞代谢层面。通过下调GLS1的表达，阻断Gln向谷氨酸的转化，减少ATP的生成，揭示了根皮素在抑制前列腺癌细胞Gln代谢中的重要机制。此外，本研究还揭示了Gln补充对前列腺癌细胞生物学行为的反向作用，以及这种作用在根皮素治疗背景下的可逆转性。这一发现提示联合治疗的潜力，在使用根皮素等抗癌药物的同时，结合Gln代谢的调节策略，可能会实现更好的治疗效果。

PDK1是PDK1/AKT/mTOR信号通路中的一个关键组成部分，当PDK1的表达或活性增加时，可以激活下游的AKT和mTOR，进而促进前列腺癌细胞的恶性行为^[17]。在前列腺癌中，PDHA1通过维持其mRNA的稳定性，激活线粒体代谢，能够促进前列腺癌的进展，并可能减弱雄激素受体信号抑制剂对前列腺肿瘤的治疗效果^[18]。关于PDHA1和肝癌的研究发现，敲除PDHA1能够损坏肝癌细胞线粒体功能，促进Gln代谢耗竭进而抑制癌细胞增殖^[19]。本研究进一步揭示了磷酸化的PDHA1在前列腺癌细胞Gln代谢调节和癌细胞生物学行为中的作用。此外，研究表明PDK1-p-PDHA1信号通路在胆管癌中发挥着关键的调控作用，通过抑制此信号通路，可以恢复肿瘤细胞的正常代谢模式，抑制其增殖并促进其凋亡^[20]。本研究发现，在前列腺癌中，PDK1及p-PDHA1的高表达导致Gln代谢途径的重编程，使细胞更倾向于通过Gln分解来提供能量和生物合成所需的中间产物。然而根皮素通过抑制PDK1，阻断了Gln代谢途径的重编程，从而抑制了前列腺癌细胞的生长和侵袭能力，并促进了其凋亡。此外，功能实验表明过表达PDK1能够逆转根皮素对细胞增殖、侵袭、凋亡以及Gln代谢的影响；并且过表达PDHA1时，能够挽救敲减PDK1的影响，恢复前列腺癌细胞对Gln的依赖和能量代谢途径的重编程，从而促进细胞的生长和增殖。

综上，PDK1-p-PDHA1信号通路在前列腺癌的Gln代谢中起关键作用，根皮素通过抑制PDK1来调控这一信号通路，进而影响前列腺癌细胞的能量代谢和生物合成途径，抑制细胞的增殖和侵袭能力，并促进凋亡。基于体外实验结果，本研究通过体内实验，进一步证实根皮素可能通过抑制PDK1-p-PDHA1信号通路并调控Gln代谢途径发挥治疗前列腺癌的作用，虽然其效果略逊于顺铂，但根皮素作为一种天然化合物可能具有更好的安全性和耐受性。因此，根皮素在治疗前列腺癌中具有潜在的应用前景，值得进一步研究和开发。然而，当前的研究主要集中在根皮素对PDK1-p-PDHA1信号通路及Gln代谢途径的初步影响上，具体的分子间相互作用仍需进一步深入探究。未来可以利用高通量测序、蛋白质组学、代谢组学等先进技术手段，全面解析根皮素对PDK1-p-PDHA1信号通路及Gln代谢途径的调控机制。同时，探讨这一调控过程与前列腺癌发生发展之间的内在联系，为前列腺癌的精准治疗提供理论依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来  源：赵  朋，杨  拓，王金铸，蔡科科，刘  鹏，念学武，王奕婷．根皮素通过抑制PDK1-p-PDHA1轴影响谷氨酰胺代谢介导的前列腺癌研究  [J]. 中草药, 2025, 56(4): 1254-1265.