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RFdiffusion 是一个开源的结构生成方法，既可以在有条件信息（如功能基序、目标蛋白等）的情况下使用，也可以在无条件的情况下使用。它能够处理多种蛋白质设计任务，具体内容在 RFdiffusion 的论文中已有详细阐述。
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Diffusion 可以完成的任务包括：
• 无条件蛋白生成（Unconditional protein generation）
• 基序支架设计（Motif Scaffolding）
• 设计多样化（“部分扩散”机制，可在已有设计周围采样变体）
• 结合蛋白设计（Binder design）
• 对称性下的无条件生成（目前已支持循环对称、二面体对称和四面体对称，未来还将支持更多类型）
• 对称性的基序支架设计（Symmetric motif scaffolding）
接下来，本文将针对上述每一类任务，分别通过具体的代码示例，展示如何使用 RFdiffusion 实现这些功能，帮助读者快速上手并应用于自己的蛋白设计问题中。
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安装
要开始使用 RFdiffusion，首先克隆该代码仓库：
Shellgit clone https://github.com/RosettaCommons/RFdiffusion.git
然后你需要将模型权重下载到 RFDiffusion 目录中：
Bashcd RFdiffusionmkdir models && cd modelswgethttp://files.ipd.uw.edu/pub/RFdiffusion/6f5902ac237024bdd0c176cb93063dc4/Base_ckpt.ptwgethttp://files.ipd.uw.edu/pub/RFdiffusion/e29311f6f1bf1af907f9ef9f44b8328b/Complex_base_ckpt.ptwgethttp://files.ipd.uw.edu/pub/RFdiffusion/60f09a193fb5e5ccdc4980417708dbab/Complex_Fold_base_ckpt.ptwgethttp://files.ipd.uw.edu/pub/RFdiffusion/74f51cfb8b440f50d70878e05361d8f0/InpaintSeq_ckpt.ptwgethttp://files.ipd.uw.edu/pub/RFdiffusion/76d00716416567174cdb7ca96e208296/InpaintSeq_Fold_ckpt.ptwget http://files.ipd.uw.edu/pub/RFdiffusion/5532d2e1f3a4738decd58b19d633b3c3/ActiveSite_ckpt.ptwgethttp://files.ipd.uw.edu/pub/RFdiffusion/12fc204edeae5b57713c5ad7dcb97d39/Base_epoch8_ckpt.ptOptional:wgethttp://files.ipd.uw.edu/pub/RFdiffusion/f572d396fae9206628714fb2ce00f72e/Complex_beta_ckpt.pt# original structure prediction weightswgethttp://files.ipd.uw.edu/pub/RFdiffusion/1befcb9b28e2f778f53d47f18b7597fa/RF_structure_prediction_weights.pt
请确保你已安装 Anaconda 或 Miniconda。
你还需要安装 NVIDIA 的 SE(3)-Transformer 实现。以下是安装该代码的方法：
Bashconda env create -f env/SE3nv.ymlconda activate SE3nvcd env/SE3Transformerpip install --no-cache-dir -r requirements.txtpython setup.py installcd ../.. # change into the root directory of the repositorypip install -e . # install the rfdiffusion module from the root of therepository
每次运行 RFdiffusion 之前，请确保通过以下命令激活对应的 conda 环境：
Shellconda activate SE3nv
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使用
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Unconditional design
我们首先来看一下如何进行一个长度为 150 个氨基酸的无条件蛋白设计。为此，我们只需要指定以下三项内容：
• 蛋白质的长度（The length of the protein）
• 我们希望保存输出文件的位置（The location where we want to write files to）
• 我们想要生成的设计数量 （The number of designs we want）
Shell./scripts/run_inference.py'contigmap.contigs=[150-150]' \inference.output_prefix=test_outputs/test \inference.num_designs=10
让我们详细来看一下。首先，什么是 contigmap.contigs？
Hydra 配置用于告诉推理脚本应如何运行。为了更好地组织配置内容，配置文件被划分为多个子配置块，其中之一就是 contigmap，它包含了与 contig 字符串 相关的所有内容（即定义将要构建的蛋白结构的部分）。
如果这一点还不清楚，你可以查看配置文件 configs/inference/base.yml 来了解更多细节。
那么，contigmap.contigs=[150-150] 是什么意思呢？
对于使用过 RFjoint inpainting 的人来说，这个格式可能看起来很熟悉，但略有不同。实际上，Diffusion 使用的“contig mapper”与 inpainting 完全相同，不同之处在于：由于我们使用的是 Hydra 配置系统，所以需要以不同的方式将 contig 信息传递给模型。
出于 Hydra 的语法要求，contig 字符串必须作为列表中的一个元素传递，而不能直接作为字符串。并且，整个参数必须用单引号包裹，以防命令行错误地解析其中的特殊字符。
contig 字符串可以用来指定一个长度范围，但在这个例子中，我们只是想要生成一个长度为 150 个氨基酸的蛋白质，因此直接写 [150-150] 即可。
这段配置将运行 10 次 diffusion 轨迹，并将生成的结构保存到你指定的输出文件夹中。
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design_unconditional
在本节中，我们将介绍如何使用 RFdiffusion 执行最基础的蛋白质设计任务：无条件蛋白生成（unconditional design）。这一模式下，模型不依赖任何输入结构、基序片段或目标信息，完全从零开始生成具备合理折叠的蛋白质结构。
Bash#!/bin/bash# Here, we're making some unconditional designs# We specify the path for the outputs# We tell RFdiffusion that designs should be 100-200 residues in length(randomly sampled each design)# We generate 10 such designs../scripts/run_inference.py \inference.output_prefix=example_outputs/unconditional/design_unconditional\'contigmap.contigs=[100-200]' \inference.num_designs=10
Shell'contigmap.contigs=[100-200]'
这行是关键配置，表示：
• 模型每次设计时都将生成一个长度在 100 到 200 个残基之间的蛋白质；
• contigmap.contigs 是 RFdiffusion 的标准格式，用于指定目标序列的组成方式；
• 在无条件设计中，它代表一个单段连续的序列，没有固定结构、功能或分段要求。
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design_unconditional_w_contact_potential
在本节中，我们基于无条件蛋白质设计，进一步引入辅助势能函数（contact potential），以引导模型生成更加紧凑、结构合理的蛋白折叠。
默认的无条件设计虽然能生成多样的蛋白结构，但有时会出现不够紧凑或内部接触不足的构象。通过加入 monomer_contacts 势能项，我们可以鼓励模型在设计过程中形成更多的链内残基接触，从而提升设计结构的可折叠性与稳定性。
Bash#!/bin/bash# Here, we're making some unconditional designs, and also using the'monomer_contacts' auxillary potential function# We specify the path for the outputs# We tell RFdiffusion that designs should be 100-200 residues in length(randomly sampled each design)# We generate 10 such designs../scripts/run_inference.py \inference.output_prefix=example_outputs/design_unconditional_w_contact_potential\'contigmap.contigs=[100-200]' \inference.num_designs=10 \'potentials.guiding_potentials=["type:monomer_contacts,weight:0.05"]'
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什么是 “with contact potential”？
“with contact potential” 的意思是：
在蛋白质设计过程中，引入了一个额外的能量函数项（即引导势函数，guiding potential），它鼓励生成的蛋白质结构中某些残基之间发生接触（即靠近形成非共价相互作用，如疏水、氢键等）。
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monomer_contacts的具体含义
• type:monomer_contacts：
• 表示这个 potential 的类型是单体接触势，它鼓励设计出的蛋白质内部有合理的残基-残基接触模式（也就是结构更紧凑、自然）。
• weight:0.05：
• 指这个接触势函数在总优化目标中的权重是 0.05，是一个相对较小的软约束（soft constraint）。它不会强制影响结果，但会倾向于引导设计向具有内部接触的结构靠拢。
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为什么要加 contact potential？
在无条件设计（unconditional design）中，模型没有提供任何结构模板或binding目标，仅凭 diffusion 自己从头生成结构。
• 如果不加任何约束，可能生成一些不自然的蛋白质（比如疏松、无内部结构）；
• monomer_contacts 会鼓励生成的结构中残基靠得更近，有利于形成稳定的折叠
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design_unconditional_w_monomer_ROG
在本节中，我们在无条件蛋白设计的基础上，引入了一种新的引导势能——单体回转半径（monomer_ROG）势能，以进一步控制生成蛋白质的整体紧凑程度。
“回转半径”（Radius of Gyration, ROG）是衡量蛋白结构是否紧密折叠的一个重要指标。通过设置 monomer_ROG 势能项，我们可以鼓励 RFdiffusion 生成的蛋白结构保持在预期的紧凑度范围内，避免出现不自然的松散构象。
Bash#!/bin/bash# Here, we're making some unconditional designs, and also using the'monomer_contacts' auxillary potential function# We specify the path for the outputs# We tell RFdiffusion that designs should be 100-200 residues in length(randomly sampled each design)# We generate 10 such designs../scripts/run_inference.py \inference.output_prefix=example_outputs/design_unconditional_w_contact_potential\'contigmap.contigs=[100-200]' \inference.num_designs=10 \'potentials.guiding_potentials=["type:monomer_contacts,weight:0.05"]'
这一段 Bash 脚本是调用 RFdiffusion 进行无条件蛋白质设计（unconditional design），但加上了一个特殊的引导势能项：monomer_ROG（单体回转半径势），用于鼓励生成的蛋白质结构更紧凑。
一句总结：
这段脚本使用了 回转半径 (Radius of Gyration, ROG) 引导势能，引导 RFdiffusion 在不提供模板的情况下生成结构更紧凑、更天然的蛋白质。
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Radius of Gyration 是什么？
• 回转半径 (ROG) 衡量结构的紧凑程度；
• 值越小，表示结构越紧密折叠；
• 大的 ROG 值意味着结构比较“松散”或拉伸。
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适用场景
适合你想：
• 控制结构的紧凑性；
• 避免生成“线性”或“非自然折叠”结构；
• 或者你准备设计结构稳定的 scaffolds 或酶核心结构。
如需进一步添加 接触势 (monomer_contacts)、二级结构约束 或其他 guiding potential，可以并列添加多个，例如：
Shell'potentials.guiding_potentials=["type:monomer_ROG,weight:1,min_dist:5","type:monomer_contacts,weight:0.1"]'
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Motif Scaffolding
RFdiffusion 可用于基序支架设计，其方式类似于 Constrained Hallucination 和 RFjoint Inpainting。总体而言，RFdiffusion 在性能上明显优于 Constrained Hallucination 和 RFjoint Inpainting。
在进行蛋白基序支架设计时，我们需要一种方式来指定：希望在哪些特定的蛋白结构片段上进行支架构建（即来自 .pdb 文件的一个或多个片段），以及希望它们之间如何连接、通过多少个残基连接到新生成的支架蛋白中。此外，我们通常并不预先知道连接基序所需的确切残基数，因此我们希望能够在设计过程中采样不同长度的连接片段。
这个输入指定的工作是通过 contigs 实现的，它受 Hydra 配置文件中的 contigmap 配置项控制。对于熟悉 Constrained Hallucination 或 RFjoint Inpainting 的用户来说，其逻辑非常相似。简要说明如下：
• 以字母开头的片段表示这是一个基序片段，字母对应于输入 .pdb 文件中的链名。例如 A10-25 表示输入结构中 A 链的第 10 到 25 个残基，即 (‘A’,10)、(‘A’,11)…(‘A’,25)。
• 没有字母前缀的片段表示是需要新设计生成的结构部分。这些部分可以用一个长度区间表示，RFdiffusion 在每次推理时都会从中随机采样长度。
• 如果需要指定链的断开位置（即生成的链不与原有片段连成一条链），使用 /0 来表示链断裂。
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design_unconditional
在本节中，我们介绍如何使用 RFdiffusion 进行基序支架设计，即在保留一个已知的功能片段（motif）的基础上，为其构建稳定的结构支架（scaffold）。
Bash#!/bin/bash# Here, we're running one of the motif-scaffolding benchmark examples# Specifically, we're scaffolding site 5 from RSV-F protein# We specify the output path and input pdb (the RSV-F protein)# We specify the protein we want to build, with the contig input:# - 10-40 residues (randomly sampled)# - residues 163-181 (inclusive) on theA chain of the input# - 10-40 residues (randomly sampled)# We generate 10 designs../scripts/run_inference.py \inference.output_prefix=example_outputs/design_motifscaffolding/design_motifscaffolding\inference.input_pdb=input_pdbs/5TPN.pdb \'contigmap.contigs=[10-40/A163-181/10-40]' \inference.num_designs=10
Shell'contigmap.contigs=[10-40/A163-181/10-40]'
这行是核心，指定构建的新蛋白应包含一个特定结构片段：
• 10-40：前导片段，随机生成长度在 10–40 个残基之间；
• A163-181：目标结构中的 motif，即 A链的残基 163 到 181，是你要保留并 scaffold 的功能区；
• 10-40：尾部片段，也是随机生成长度为 10–40 的残基。
整个结构最终是：新生成的前段 + motif + 新生成的后段
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motif scaffolding 是什么？
Motif scaffolding 是结构设计中一种常见任务：
保留一个已知的功能性片段（motif），并为其设计稳定的两侧支撑结构（scaffold），以便在新蛋白中保留该功能。
在生物医学中，motif 通常是：
• 表位（epitope）
• 结合位点（binding site）
• 酶活性位点（catalytic site）
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design_motifscaffolding_with_target
在本节中，我们展示如何使用 RFdiffusion 进行带结合目标的基序支架设计，即在设计支架的同时，考虑目标蛋白的空间限制，使所生成的结构具备特定的结合能力。
与普通的 motif scaffolding 不同，此任务中不仅需要保留功能基序，还需要保证其在设计后能与一个已知目标蛋白（如受体、抗原）形成稳定的相互作用。这在设计结合肽段、疫苗抗原、受体识别位点等场景中尤为关键。
Bash#!/bin/bash# Here, we're running one of the motif-scaffolding benchmark examples, in the presenceof a target# Specifically, we're scaffolding the Mdm2-interacting peptide from p53# We specify the output path and input pdb (the p53-Mdm2 complex)# We specify the protein we want to build, with the contig input:# - the Mdm2 target protein (residuesA25-109), with a chain break.# - 0-70 residues (randomly sampled)# - residues 17-29 (inclusive) on the Bchain of the input (the p53 helix)# - 0-70 residues (randomly sampled)# We also constrain the total length of the diffused chain to be within 70 and120 residues# We generate 10 designs# As in the paper (at least for some of the designs we tested), we use thecomplex-finetuned modelpython ../scripts/run_inference.py \inference.output_prefix=example_outputs/design_motifscaffolding_with_target/design_motifscaffolding_with_target\inference.input_pdb=input_pdbs/1YCR.pdb \'contigmap.contigs=[A25-109/00-70/B17-29/0-70]' \contigmap.length=70-120 \inference.num_designs=10 \inference.ckpt_override_path=../models/Complex_base_ckpt.pt
这段脚本运行的是 RFdiffusion 的 motif-scaffolding 设计任务，但和你之前提供的相比，它是一个更高级的版本：
→ 在保留功能片段（motif）的同时，还需要考虑目标蛋白（target）的结合要求。
也就是说，这不是简单的 scaffold 结构，而是设计一个蛋白质片段，让它能嵌入 motif 并与目标蛋白相互作用。
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总体目标
设计一个新的蛋白质结构，它：
• 包含 p53 的功能性螺旋（B17–29）；
• 能够结合 Mdm2 的结构区域（A25–109）；
• 满足整体长度限制（70–120 个残基）；
• 使用了为复合物优化的 RFdiffusion 模型（Complex_base_ckpt.pt）；
Shellinference.input_pdb=input_pdbs/1YCR.pdb
输入结构是 p53–Mdm2 蛋白复合物，PDB 编号 1YCR。其中：
• 链 A 是 Mdm2；
• 链 B 是 p53。
Shell'contigmap.contigs=[A25-109/0 0-70/B17-29/0-70]'
这段是核心的结构指定，解释如下：
➤ A25-109
• 保留目标蛋白 Mdm2 的结构，链 A 的残基 25–109。
➤ / ：表示断开结构链
• Mdm2 是目标蛋白，不是你要设计的链，因此与新设计之间有断点。
➤ 0 0-70
• 中间插入一段设计片段，长度在 0–70 个残基之间；
• 0 0-70 是 RFdiffusion 中的一个容错写法，有时第一个 0 用作 placeholder。
➤ B17-29
• 这是要嵌入的 motif 片段，是 p53 的 α-螺旋区，也是与 Mdm2 结合的关键片段。
➤ /0-70
• 在 motif 的后面再设计一段 0–70 个残基的片段。
Shellcontigmap.length=70-120
限制设计的新链长度在 70–120 个残基之间。
这通常用于约束生成结果在合理大小范围，避免过长或过短。
Shellinference.ckpt_override_path=../models/Complex_base_ckpt.pt
指定使用一个为复合物设计微调过的模型 checkpoint。这个模型特别适合用来设计结合目标蛋白的结构，比默认的 RFdiffusion 模型更适合这类任务。
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design_motifscaffolding_inpaintseq
在本节中，我们介绍如何使用 RFdiffusion 实现序列可变的基序支架设计（inpaint sequence）。该任务在传统 motif scaffolding 的基础上，进一步允许基序中某些残基的氨基酸序列发生变化，从而获得更好的空间适配性与结构紧凑度。
Bash#!/bin/bash# Here, we're running one of the motif-scaffolding benchmark examples# Specifically, we're scaffolding site 5 from RSV-F protein# This is equivalent to the example in design_motifscaffolding.sh, except thatwe're adding the contigmap.inpaint_seq flag# The logic here is that only some of the amino acids are important for thefunction of the motif, and others can be redesigned.# This can promote better packing, as RFdiffusion is not forced to pack againstspecific (but unimportant) residues on the back-side of the motif# We specify the output path and input pdb (the RSV-F protein)# We specify the protein we want to build, with the contig input:# - 10-40 residues (randomly sampled)# - residues 163-181 (inclusive) on theA chain of the input# - 10-40 residues (randomly sampled)# We generate 10 designs# We then specify that residues 163-168 (inclusive), 170-171 (inclusive) and179 (inclusive) on the A chain of the input, should be masked in the input../scripts/run_inference.py \inference.output_prefix=example_outputs/design_motifscaffolding_inpaintseq/design_motifscaffolding_inpaintseq\inference.input_pdb=input_pdbs/5TPN.pdb \'contigmap.contigs=[10-40/A163-181/10-40]' \inference.num_designs=10 \'contigmap.inpaint_seq=[A163-168/A170-171/A179]'
这段脚本是在运行 RFdiffusion 的 motif scaffolding 任务，其目标是：
• 保留 RSV-F 蛋白中的一个功能性结构片段（A163–181）；
• 在其两侧构建新结构（scaffold）；
• 并且特别指出：motif 内的部分残基不重要，可以重新设计，以获得更好的结构紧凑性或折叠质量。
Shellinference.input_pdb=input_pdbs/5TPN.pdb
输入结构是 RSV-F 蛋白，PDB 编号为 5TPN，其中：
• A 链包含目标 motif 区（site 5），残基范围 163–181。
Shell'contigmap.contigs=[10-40/A163-181/10-40]'
这是指定要构建的目标结构：
• 10-40：前导随机结构片段，长度 10–40 个残基；
• A163-181：motif 片段，RSV-F 的关键功能区；
• 10-40：尾部随机结构片段，长度 10–40。
即：
Shell随机结构 + 功能片段 + 随机结构
Shell'contigmap.inpaint_seq=[A163-168/A170-171/A179]'
这是该示例的关键创新点：
contigmap.inpaint_seq
这个参数告诉 RFdiffusion：
motif 片段中某些残基可以“遮罩”掉（即不固定其序列），在设计过程中可以自由更改其氨基酸类型。
作用：
• 默认情况下，RFdiffusion 会保留输入结构中 motif 的序列和结构；
• 但有时，motif 中的一部分残基对功能不重要，仅提供支撑结构；
• 这些残基可以重新设计（inpaint），从而让周围 scaffold 更容易 pack 得更好、整体折叠更合理。
这里遮罩掉的残基：
• A链的 163–168
• A链的 170–171
• A链的 179
这些位置的氨基酸可以被重新设计。
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背后逻辑
• motif 片段不是每个残基都同等重要；
• 保留关键位点的氨基酸，而重新设计非关键区域，可以提高整体折叠质量和多样性；
• 这在 binder 设计、疫苗设计、或enzyme engineering 中非常常见。
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总结
RFdiffusion 是一个开源的蛋白质结构设计工具，基于扩散模型，支持多种设计任务。本文重点介绍了其安装方式、无条件设计和 motif scaffolding 的使用方法。
· 安装：通过克隆仓库、下载模型权重，配置 Conda 环境及依赖，即可完成安装。
· 无条件蛋白生成：
o 可生成指定长度的全新蛋白结构（如 [100-200] 残基）；
o 可加入辅助势能如 monomer_contacts（鼓励内部接触）或 monomer_ROG（控制结构紧凑性），提升设计质量。
· Motif scaffolding（基序支架设计）：
o 在已知功能片段（motif）两侧生成支撑结构；
o 支持与目标蛋白结合的设计（如 p53–Mdm2）；
o 可选择性重新设计 motif 内不重要的残基（inpaint_seq），提高适配性与结构紧凑度。
精彩回顾
供稿 | 刘安吉
责编 | 囡囡
设计 / 排版 | 可洲
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