【论著】浓缩生长因子对氧化应激状态下人牙髓干细胞生物学性能的影响

目的

探讨浓缩生长因子（CGF）对过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化应激状态下人牙髓干细胞（hDPSC）生物学性能的影响。

方法

采用组织块分离法从因正畸拔除的健康恒牙中提取hDPSC，流式细胞术检测hDPSC的表面标志物CD34、CD45、CD90、CD105，碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S、油红O染色和集落形成实验对hDPSC进行鉴定。细胞计数试剂盒（CCK-8）检测后选用最适H₂O₂浓度构建hDPSC氧化应激模型。采用反复冻融法制备CGF条件培养基，CCK-8检测后选用最适CGF浓度用于后续实验。将hDPSC分为对照组、H₂O₂组（H₂O₂单独处理）、H₂O₂+CGF组（H₂O₂联合CGF处理）和CGF组（CGF单独处理），细胞分组后进行后续所有实验。应用活性氧、β-半乳糖苷酶染色和蛋白质印迹法对氧化应激模型进行验证。CCK-8和细胞划痕实验分别检测CGF对氧化应激状态下hDPSC增殖和迁移能力的影响；ALP及茜素红S染色检测CGF对氧化应激状态下hDPSC成骨分化能力的影响；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测成牙相关基因mRNA的表达，蛋白质印迹法检测成牙、成骨相关蛋白的表达。

结果

分离培养的hDPSC阳性表达间充质干细胞表面标志物CD90、CD105，阴性表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45；hDPSC具有成骨、成脂向分化能力和克隆形成能力。200 μmol/L H₂O₂为构建氧化应激模型的最适浓度。20%CGF为用于后续实验的最适CGF浓度。与对照组相比，H₂O₂组衰老蛋白p53表达从（0.82±0.12）显著上调至（1.19±0.14）（ P<0.05），β-半乳糖苷酶染色加深、活性氧荧光强度增加。H₂O₂+CGF组在第1、3、5、7天的增殖能力（0.23±0.01、0.50±0.02、1.60±0.07、1.80±0.21）均显著高于H₂O₂组（0.15±0.01、0.14±0.02、0.50±0.03、0.90±0.09）（均P<0.05）；且H₂O₂+CGF组在12、24 h的细胞愈合能力［（47±7）%、（58±44）%］也均显著高于H₂O₂组［（36±2）%、（44±2）%］（均 P<0.05），ALP活性和矿化结节形成增加；在第28天时H₂O₂组中成牙相关基因牙本质涎磷蛋白（DSPP）（0.52±0.16）、牙本质基质蛋白-1（DMP-1）的mRNA表达（0.39±0.13）均显著低于H₂O₂+CGF组（分别为0.96±0.24、0.83±0.30）和CGF组（分别为1.12±0.18、1.23±0.19）（均 P<0.05）；第28天时H₂O₂组成牙相关蛋白DMP-1（0.27±0.04）、成骨相关蛋白Runt相关转录因子2（0.42±0.15）的表达均显著低于H₂O₂+CGF组（分别为0.66±0.18、0.68±0.04）和CGF组（分别为1.15±0.13、1.06±0.19）（均 P<0.05）。

结论

H₂O₂能诱导hDPSC氧化应激模型，CGF能促进氧化应激状态下hDPSC的增殖、迁移和成牙、成骨向分化能力。

人牙髓干细胞（human dental pulp stem cell，hDPSC）因具备易分离培养、高度增殖、低免疫原性和多向分化等特性，可作为牙髓再生领域理想的种子细胞 ^［ 1 ］ 。浓缩生长因子（concentrated growth factor，CGF）是新一代血液提取物，采用差速离心法制备的CGF具有安全、能释放大量生长因子、形成的纤维结构更致密等优点，其不仅可作为有利于干细胞附着的支架材料，还可作为生长因子为干细胞提供营养 ^［ 2 ］ 。

有研究表明氧化应激是机体的一种破坏性反应，能促使细胞内活性氧水平异常升高，导致细胞衰老 ^［ 3 ］ 。而过氧化氢（hydrogen peroxide，H₂O₂）作为主要的活性氧簇之一，能诱发机体处于氧化应激状态，降低细胞性能 ^［ 4 ］ 。而氧化应激反应可造成牙髓、牙周以及根尖周病变，加重牙髓炎症程度和牙周组织损伤 ^{［ 5 , 6 ］} 。已有研究证实CGF能促进脂多糖诱导的炎症微环境下hDPSC增殖、迁移和分化 ^［ 7 ］ 。目前探讨CGF对H₂O₂诱导的氧化应激状态下干细胞生物学性能的相关研究较少。本研究旨在探讨CGF对H₂O₂导致的氧化应激状态下hDPSC形态、增殖、迁移和成牙、成骨向分化能力的影响，为CGF联合hDPSC促进牙髓组织修复及再生提供思路。