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BioLegend新品-ATP Red助力细胞代谢研究

跨境人老刘

2025-08-22

导读：BioLegend开发了此直接且简化的流式细胞术方法（cat#421944，ATP Red）

导语

T细胞的活化和分化依赖于糖酵解、氧化磷酸化、脂肪酸代谢等必需代谢途径的动态变化。为了改进免疫治疗方法，需要更深入地了解免疫细胞功能的代谢调节。

嘌呤霉素掺入新生多肽已被用于流式细胞术代谢分析（Scenith法）。然而，该方法耗时较长，需要细胞固定和透化处理。此外，该方法无法直接测量细胞内可用ATP水平。嘌呤霉素可刺激多肽合成并抑制胰岛素刺激的糖酵解增加嘌呤霉素标记在不同细胞类型中不可靠，且不能准确测量能量受限细胞中的翻译速率。

BioLegend

流式细胞术方法 (cat#421944，ATP Red)

BioLegend开发了此直接且简化的流式细胞术方法（cat#421944，ATP Red），用于检测活细胞中的ATP水平。该技术不仅能有效识别稀有亚群，还能精准解析糖酵解、氧化磷酸化等关键代谢通路。其操作快速高效——检测结果可在1小时内获得（相比之下，使用嘌呤霉素法需耗时超过2小时），并能准确测定细胞ATP生成量及其对目标代谢通路的依赖性。

目前还有试用装可提供，感兴趣的老师可与达科为销售联系。数量有限，先到先得!

一.

ATP产生路径

糖酵解和氧化磷酸化：葡萄糖产生的ATP

二.

T细胞激活、分化和记忆形成过程中

发生的代谢变化

• Naive T细胞代谢上处于静止状态，主要依靠氧化磷酸化（OxPhos）来满足其能量需求和存活。

• 当Naive T受到抗原刺激后，迅速转变为效应T细胞，此时效应T细胞代谢非常活跃，其糖酵解和氧化磷酸化速率较高，与它们的高度增殖状态有关。

• 随着时间的推移，当细胞再次遇到相同抗原刺激时，效应记忆T细胞迅速响应。效应记忆T细胞（TEM）的代谢需求很大程度上依赖于糖酵解。

• T细胞在抗原识别后重新编程其细胞代谢为有氧糖酵解，以获得效应功能。

三.

检测方法

ATP Flow on human whole blood

将人全血分别用10 mM 2-脱氧-D-葡萄糖（DG）、1 μM寡霉素(O)、两者的混合物（DGO）或buffer（对照组）在37°C下处理5分钟，随后用1x红细胞裂解/固定液（cat#422401）裂解15分钟。细胞经FACS洗涤缓冲液洗涤后，重悬于cell staining buffer 中（cat#420201)，细胞经ATP-Red和CD3-（克隆UCHT1) Spark Red™718、CD4-（克隆SK3）APC/ Fire™750、CD8-（克隆RPA-T8) Spark Violet™423、CD197-（克隆G043H7）PE/Fire™640以及CD45RA-（克隆HI100) APC染色后，使用FACS洗涤缓冲液清洗细胞。通过流式分析软件在PE通道测量ATP-Red的平均荧光强度（MFI）。

利用ATP-Red对人T细胞进行代谢分析

流式细胞术通过ATP Flow分析人类T细胞亚群检测代谢差异

•Naive T细胞的代谢需求较低，对糖酵解依赖性较低，对氧化磷酸化依赖性较高。

•效应记忆T细胞对糖酵解的依赖性更高。

ATP Flow测量T细胞亚群的代谢活性

•Naive T细胞的代谢活性较低

•记忆T细胞和效应T细胞的ATP水平较高

ATP Flow on human activated T cells

将人外周血单核细胞分别用固定化的Ultra-LEAF™纯化CD3（克隆UCHT1，cat#300437)和Ultra-LEAF™纯化CD28（克隆CD28.2，cat#302933)刺激处理24小时或3天。收集细胞后重悬于细胞染色缓冲液中，随后在37°C条件下分别加入10 mM 2-脱氧-D-葡萄糖（DG）、1 μM寡霉素(O)、二者的混合（DGO），或以溶媒作为对照（对照组）进行30分钟孵育。接着用FACS洗涤缓冲液清洗细胞，重悬于细胞染色缓冲液后，使用ATP-Red荧光染料与CD3-（克隆UCHT1)Spark Red™718进行染色。最后用FACS洗涤缓冲液清洗细胞后进行分析。使用流式分析软件在PE通道中测量ATP-Red的平均荧光强度（MFI）。

CD3/CD28 24小时激活的T细胞增加糖酵解

•激活的T细胞增加了代谢需求，增加了对糖酵解的依赖

CD3/CD28 3天激活的T细胞增加糖酵解和氧化磷酸化

ATP Flow on murine splenocytes

将C57BL/6小鼠脾细胞重悬于RPMI培养基中，分别用5 mM 2-脱氧-D-葡萄糖（DG）、0.25 μM寡霉素(O)、二者的混合物（DGO）或溶媒（对照组）在37°C下处理30分钟，随后用固定缓冲液（cat#420801）固定15分钟。细胞经FACS洗涤缓冲液清洗后，重新悬浮于细胞染色缓冲液中，依次使用ATP-Red荧光染料、CD30（克隆17A2) Spark Violet™423、CD4-（克隆RM4-4）APC/Fire™750、CD44-（克隆IM7) PE/Cyanine7以及CD62L-克隆MEL-14) APC进行染色。分析前再次用FACS洗涤缓冲液清洗细胞。通过流式分析软件在PE通道测量ATP-Red的平均荧光强度。

ATP Imaging

将A549细胞接种于带盖玻片的96孔板中，使用含10% FBS的DMEM培养基进行培养。随后用2-脱氧-D-葡萄糖（DG）、寡霉素(O)或两者的组合（DGO）处理细胞30分钟（37°C），最后用ATP-Red染色15分钟。用PBS洗涤细胞，使用标准Epifluorescence显微镜上的40倍物镜成像，并使用ImageJ进行分析。