2025年1月，《Nature》 期刊发布了《2025年值得关注的全球七大突破性技术》，涵盖生命科学、人工智能、光子计算、环境治理等多个前沿领域。其中，生命科学领域独占四席：CAR-T细胞疗法、生物修复技术、生物领域AI基础模型、单细胞微生物分析。这些技术不仅有望革新疾病治疗、优化生态保护，还将推动生物学研究迈入全新维度。无论是实验室里的分子突破，还是城市中的可持续创新，这份榜单勾勒出未来科技的壮丽蓝图。【1】
微生物群落在海洋、土壤和人体中极为复杂，即使是单一物种，如大肠杆菌的基因组和功能多样性也十分显著。单细胞微生物学是指通过单细胞水平的技术研究微生物个体，其核心突破在于“单细胞转录组学技术”。这项技术能捕捉每个细菌细胞的RNA表达差异，揭示传统群体分析无法发现的"劳动分工"现象——比如同一菌株中不同细胞会分别承担合成生物膜组分、代谢毒素等任务。
2025年9月4日发表在《Science》上的最新研究综述：《Dissecting microbial communities with single-cell transcriptome analysis（利用单细胞转录组分析技术剖析微生物群落）》，总结并展望了最新的单细胞转录组技术在微生物领域的应用成果。
图1. 《Science》论文标题。【4】
寄居在我们体内的微生物群落，即微生物组，对我们的发育、代谢和抗感染能力至关重要。这些由数千种原核生物和真核生物（如真菌）构成的复杂生态系统，近年来通过16S rRNA测序和宏基因组测序等技术，在物种组成和基因组层面得到了深入解析，揭示了其在健康和疾病状态下的多样性。然而，这些传统方法只能提供群体水平的平均信息，无法揭示微生物群落中基因表达的动态变化和细胞间的异质性。宏转录组学能一定程度上反映基因表达情况，但无法区分同一物种内不同细胞亚群的转录状态差异。要揭示微生物群落功能的内在机制，就需要超越对总体分类组成的研究，而去检测不同亚群之间的相互作用。近年来，单细胞技术（如单细胞RNA测序、流式细胞术和FISH）的发展为理解微生物组的空间结构和功能提供了新视角。作者强调了单细胞技术在人类健康和疾病中剖析微生物组的应用，这些应用揭示了肠道群落内的功能异质性、抗生素反应以及移动遗传元件的动态变化。随着单细胞基因表达技术的不断发展，它们对于研究和调节微生物群落在临床和更广泛环境中的作用变得愈发重要。作者回顾了这些技术的发展进程，并讨论了将其应用于微生物群落时所面临的机遇与挑战。【2】
图2. 细胞层面的微生物群落。【4】
（A）微生物群落是相互作用的多物种群体，但总体分析会掩盖同一物种细胞之间由于环境和遗传差异而产生的功能多样性。（B）这些示意性的降维图展示了如何根据基因表达谱来识别不同的亚群。单细胞转录组学有助于揭示这种异质性在功能方面的表现，并在细胞层面剖析微生物生态系统。
单细胞转录组学方法在哺乳动物生物学领域取得了重大突破，但一些挑战却阻碍了其在微生物领域的应用。例如，微生物的刚性细胞壁结构使其无法用针对哺乳动物细胞膜包膜设计的裂解方法破坏。尽管哺乳动物的mRNA可以通过其多聚腺苷酸（poly(A)）尾部进行靶向，但原核生物中缺乏mRNA的多聚腺苷酸化过程需要专门的方法来捕获和逆转录mRNA。此外，微生物的mRNA含量比哺乳动物细胞低10^2至10^3倍，而且细菌mRNA在细胞内的半衰期也远短于哺乳动物mRNA。为了克服这些问题，近年来出现了许多针对微生物单细胞转录组学的方法（图3）。【4】
这些技术分为两大类【4】：
（i）基于测序的方法（单细胞RNA测序，scRNA-seq）;
（ii）源自荧光原位杂交（FISH）的显微镜方法。
图3. 细菌单细胞转录组方法的比较，红框是“细菌-MERFISH”技术。【4】
2.1
单细胞RNA测序技术
在scRNA-seq分析前，需立即固定微生物单细胞悬浮液以防止RNA降解，并通过酶消化细胞壁实现透化。由于细菌mRNA缺乏poly(A)尾巴，其捕获需采用随机引物法、使用RNA多聚（A）聚合酶添加多聚（A）尾或设计基因特异性探针来捕获，但随机引物法会导致大量rRNA被测序。为此，开发了多种rRNA剔除策略，如Cas9靶向切割、RNase H裂解及cDNA下拉。细胞特异性条形码标记广泛应用，但其实现方式各异：组合索引方法（如Petri-seq、MicroSPLiT、BacSSH-seq）（图4A）通过原位cDNA合成和迭代拆分池策略标记细胞，无需物理分离即可高通量分析数万细胞；而基于液滴的方法（如ProBac-seq、Random-seq）（图4B）则利用纳升级液滴进行高通量分选，但有的需物种特异性探针；混合方法（如BacDrop、M3-seq）结合了纳米滴技术和组合式索引技术，可实现百万级细胞的高通量测序。真菌虽具真核生物poly(A)尾巴，但需酶透化细胞壁，其scRNA-seq可适配液滴或SPLiT-seq方案。SPLiT-seq 包含随机六聚体引物的结合可能尤为重要，因为它与细菌组合式索引协议有密切相似之处，这表明跨界域单微生物转录分析是可行的。【2】【4】
图4. 微生物单细胞转录组学技术原理。【4】
2.2
FISH技术
基于荧光原位杂交（FISH）的显微检测方法能够提供单细胞分辨率以及从微生物群落到 mRNA 分子在亚细胞层面的定位等空间信息（图4E）。与单细胞RNA测序（scRNA-seq）不同，这些方法不仅可以应用于单个固定细胞，还可以应用于生物膜或宿主组织。例如，基于 seqFISH 技术构建的并行顺序FISH（par-seqFISH）已被用于对浮游和生物膜中的铜绿假单胞菌细胞中的105个标志基因进行表达分析。这种方法能够可视化生物膜内的空间异质性以及与运动和毒素相关基因的亚细胞定位。组合条形码的使用可以进一步扩大基于FISH方法捕获的基因范围，但在处理细菌时存在一个问题，即与哺乳动物细胞相比，细菌中的mRNA转录本密度更高，这阻碍了全转录组范围内的组合条形码技术应用，因为不同mRNA物种产生的荧光点的分辨率不足。【2】【4】
一种名为“扩展显微镜技术”的方法解决了这一难题，该技术将固定的细菌嵌入到一个基质中，并将其物理地膨胀到更大的体积。当与细菌-多重抗误差荧光原位杂交（MERFISH）技术相结合时，可以对高达80%的基因的转录本进行定量。以往，人们认为该类方法在可捕获细胞数量与转录组覆盖范围之间存在权衡，且依赖于物种特异性探针设计，限制了其在多物种群落中的普适性应用，同时探针特异性验证和高通量自动化设备需求也极具技术挑战。现在，经过对MERFISH技术的进一步优化，可以极大地提高MERFISH检测细菌RNA的能力，体现了FISH技术的核心优势：即能够在原位解析细菌群落的同时保留空间信息。【2】【4】
2025年1月24日发表在《Science》杂志上的一项新研究《Highly multiplexed spatial transcriptomics in bacteria（细菌中的高通量空间转录组学研究）》中，Vizgen联合创始人杰弗里・莫菲特（Jeffrey R. Moffitt）和他在波士顿儿童医院的团队利用扩展显微镜对MERFISH进行了优化，实现了在单一细菌中同时分析数千个mRNA。
图5. 《Science》论文标题。【5】
研究背景：许多涉及整个群体的细菌现象是由单个细胞的异质性决策所驱动的，其中罕见的表型在诸如应激反应、抗生素抗性以及致病性等行为中发挥着关键作用。与此同时，许多细菌行为发生在复杂的、往往具有结构特征的环境中，而这些环境通常无法通过试管实验很好地模拟。从这个角度来看，基于图像的单细胞转录组学方法（其能够在细胞所在的真实环境中提供全基因组的基因表达信息）对于研究各种微生物问题具有巨大的潜力。然而，这些方法尚未应用于细菌领域。【5】
原理：核心难题在于细菌细胞内RNA的高密度分布。基于图像的单细胞转录组学方法需要对单个RNA分子的荧光信号进行解析以识别它们，然而细菌细胞内RNA的密度可能高到常规显微镜无法分辨单个分子的程度。为解决这一难题，作者在本研究中开发了一种针对细菌的优化扩增显微镜工具，该工具能够将单个细菌细胞的体积扩展至约1000倍。然后，作者将这些扩增方法与多重抗误差荧光原位杂交技术（MERFISH）相结合，创建了一种基于图像的单细胞转录组学方法，称之为“细菌-MERFISH”，能够在一个多样化的环境中在单个细胞内分辨出细菌转录组的大部分内容。【5】
实验结果：作者对处于对数生长期的大肠杆菌细胞进行了细菌-MERFISH 测序，并证明了其能够使细胞体积扩大约50倍或1000倍，从而能够在单个细胞中对高达80%的大肠杆菌转录组进行分析。通过测量97、1057或1930个基因簇，作者证明了细菌-MERFISH 是准确、灵敏且具有高通量的。为了展示其发现潜力，他们首先将细菌-MERFISH 应用于研究大肠杆菌对碳源从葡萄糖到木糖转变的反应。发现反应具有显著的异质性，单个大肠杆菌细胞会逐步探索各种碳利用基因簇，然后表达与木糖利用相关的基因簇。接下来，利用细菌-MERFISH 的亚细胞分辨率来绘制大肠杆菌转录组的细胞内组织结构。发现了由基因组和蛋白质组结构共同塑造的多种空间模式。最后，作者使用细菌-MERFISH对人类肠道共生菌——泰氏拟杆菌（B. theta）在小鼠结肠中的空间适应性进行了分析。发现贝氏球菌能够根据微米尺度范围内的变化来调节其基因表达，这很可能是因为其对来自食物或宿主的多糖的局部可得性做出了反应。【5】
图6. 细菌-MERFISH能够在各种环境中对单个细胞中的数千个基因簇进行分析。细菌型 MERFISH 通过优化的扩增显微镜工具包克服了细菌mRNA的高密度问题，该工具包能够将单个细胞的体积扩大约1000倍。然后，MERFISH 会在数百万个细胞中绘制出大量转录组的表达情况，从而为了解细菌的单细胞异质性、转录组在细胞内的组织结构以及细菌对肠道微米级生态位的适应性提供了见解。【5】
结论：综合来看，这些测量结果表明，细菌-MERFISH是一种性能卓越的细菌单细胞转录组分析方法。鉴于其具备的高灵敏度、多重检测能力、高通量以及空间分辨率等特性，作者预计“细菌-MERFISH”将成为探索各种微生物学问题的强大工具，涵盖从微观到宏观的不同尺度，包括细胞内结构、生物膜内的特化现象、抗生素耐药性休眠体的动态变化、病原体形成过程中的宿主-微生物相互作用，以及复杂微生物群落内的细菌间动态关系等。【5】
杰弗里・莫菲特评语
这些基于成像的方法的优势在于，我们能够深入观察感染细胞的内部，识别单个细菌，并分析它们的活动情况。如果同一细胞中的不同细菌存在差异，我们也能清晰地描绘它们各自的行为模式。因为检测探针的高度目标性，所以不必担心真核生物的 mRNA 和细菌的 RNA 之间显著数量级的不平衡。
"The advantage these image-based methods have is that we can really look within an infected cell. We could see individual bacteria. We could profile what those bacteria are doing, if there are differences between different bacteria in the same cell. And because we're targeted, we don't have to worry about this massive imbalance between the eukaryotic mRNA and the bacteria RNA.【3】
我们现在拥有强有力的工具来解答关于宿主-微生物及微生物-微生物相互作用的重要科学问题。
我们可以研究细菌如何相互交流、竞争空间生态位，并揭示微生物群落的组织结构。我们还可以探询病原菌在感染哺乳动物细胞过程中如何调控自身基因表达。
We now have the tools to answer fascinating questions about host-microbe and microbe-microbe interactions,” Moffitt says. “We can explore how bacteria might communicate and compete for spatial niches and define the structure of microbial communities. And we can ask how pathogenic bacteria adjust their gene expression as they infect mammalian cells.【3】
在复杂环境中做出的单细胞决策是许多细菌现象的基础。基于图像的转录组学方法为研究此类行为提供了一条途径，但这些方法受到了细菌mRNA 高密度的阻碍。为了克服这一挑战，研究者创建了结合了 1000 倍体积扩增与多重抗误差荧光原位杂交（MERFISH）技术的“细菌-MERFISH 方法”。这种方法能够对单个细菌内的数千个基因簇进行高通量、空间分辨率的分析。通过细菌-MERFISH 方法，研究者剖析了大肠杆菌对碳饥饿的反应，系统地绘制了细胞内 RNA 的亚细胞组织结构，并描绘了肠道共生菌Bacteroides thetaiotaomicron如何适应哺乳动物结肠微米级的微环境。细菌-MERFISH 方法将广泛适用于在各种空间结构多样且自然的环境中研究细菌的单细胞异质性，为“单细胞微生物学”提供强有力的研究工具并将取得突破性的成果。【5】
参考文献：
【1】未来已来！Nature盘点2025年七大黑科技，生命科学独占四席，生信人公众号，2025年8月17日
【2】《Science》最新综述：单细胞技术如何揭开微生物群落的秘密！美格科服公众号，2025年9月10日
【3】Science新作 | MERFISH 揭示细菌基因表达谱，提供空间转录组学应用于微生物感染与宿主免疫的新视角，Vizgen公众号，2025年2月14日
【4】Andrew W. Pountain et. al. Dissecting microbial communities with single-cell transcriptome analysis, Science, 2025-9-4, Vol 389, Issue 6764, DOI: 10.1126/science.adp6252
【5】Ari Sarfatis et. al. Highly multiplexed spatial transcriptomics in bacteria, Science, 2025-1-24, Vol 387, Issue 6732, DOI:10.1126/science.adr0932.
空间多组学是目前生命科学和基础医学领域的重要研究热点，其中Spatially Resolved Transcriptomics“空间转录组学”被 《Nature Methods》 评为Method of the Year 2020，并指出它“将改变细胞生物学以及病理学和组织学的研究和工作方式”。
MERFISH“Multiflexed Error Robust Fluorescence In-Situ Hybridization（多重抗误差荧光原位杂交）”技术，结合smFISH（单分子荧光原位杂交技术）和亚细胞成像的优势，通过使用组合标记、序列成像和抗误差的条形码编码技术来扩展smFISH的功能，从而大幅提高了多重检测能力，能够实现真正意义上基因可视化的单细胞原位空间转录组学分析，为研究人员开启了了解每个细胞内转录组组成与分布的窗口。
MERFISH技术诞生于美国哈佛大学庄小威院士实验室，于2015年首次发表，此后已累计发表了300多篇经过同行评审的文章，每年都有更多令人兴奋的发现。凭借可靠、有价值的数据集以及值得信赖的数据质量，该技术让科学家对空间基因组学分析充满信心，从而推动生物学研究。
图7. MERFISH技术原理示意图。
MERFISH 2.0技术可显著提高MERFISH在各种样本中，特别是在RNA质量较低的FFPE组织样本中的检测灵敏度。具体介绍，请参考：MERFISH 2.0：新一代空转技术，挑战低质量样本检测！
图8. MERFISH 2.0技术原理示意图。
美国Vizgen公司的MERSCOPE系列“超高分辨单细胞原位空间组学分析系统”以革命性的MERFISH技术为基础，可在亚细胞分辨率下实现大规模多重的核酸与蛋白分子成像，具有高精度和无与伦比的检测效率。MERSCOPE为肿瘤学、免疫学、神经科学、发育生物学、植物学、传染病、细胞和基因治疗等领域基于组织的基础研究和医学转化提供了变革性的视角，也是加速药物发现和开发的重要工具。
图9. MERSCOPE Ultra系统。
MERSCOPE的技术特点：
空间分辨率极高：单分子分辨率<50nm，在亚细胞水平上定位RNA转录本；
灵敏度高：能检测到其它方法（单细胞测序等）检测不到的低表达基因；
成像面积大、更快的分析速度：MERSCOPE Ultra：成像面积≥3.0cm2；
高度多重：同一切片上同时检测上千重基因与多个蛋白；MERFISH 2.0 技术适合长期保存/低质量的FFPE样本；
开放性与灵活性良好：针对课题可以灵活自主选择所需基因，专用平台高效设计基因panel。
图10. MERSCOPE图像示例。
图11. MERFISH和MERSCOPE有多篇高水平文献发表。
关于MERFISH与MERSCOPE®
MERFISH技术由哈佛大学庄小威教授团队开发，通过探针组合标记和纠错条形码扩展smFISH功能，以纳米精度检测RNA，揭示细胞内转录组组成。MERSCOPE™系统结合MERFISH技术，提供超高分辨率单细胞空间基因组学分析，是全球首个结合单细胞和空间基因组学的超多重检测平台。它整合高分辨率成像、流体学、图像数据处理和自动化，提供端到端解决方案，助力科学家深入探索空间生物学信息，生成包括RNA表达、细胞类型和组织结构的生物图谱，为生物学研究提供新深度。
关于Vizgen®
Vizgen®专注于空间生物组学，提供原位单细胞空间基因组学和蛋白组学工具。其MERFISH技术和MERSCOPE®平台结合InSituPlex®检测及STARVUE™图像分析技术，帮助研究人员在空间背景下深入了解生物系统，推动健康和疾病研究。MERSCOPE®平台在多个领域提供变革性见解，助力药物发现。更多详情，请访问www.vizgen.com，或通过社交媒体联系我们。
关于森西赛智
Vizgen 的中国区战略合作伙伴“森西赛智科技有限公司”将和 Vizgen 团队携手共同打造国内高水平单细胞原位空间组学分析技术和服务平台。
森西赛智（北京/上海/广州/成都）拥有超过20年的生命科学和生物技术领域的自主研发和国际品牌代理经验，专注于国内整合和推进全球产品进入中国的研发市场，产品线覆盖分子、蛋白、细胞、组织、小动物、生物工艺和自动化等领域。森西赛智在全国各主要城市都有销售或售后服务网点，相关工作人员均接受原厂培训，具有雄厚的技术支持基础，可以为客户提供专业周到的服务。自成立以来，“森西赛智科技有限公司”已为5300+客户提供优质的产品和服务。
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