大豆是我国重要的粮食作物和经济作物，其富含的异黄酮具有抗氧化、抗炎、调节内分泌等多种生理活性，对人体健康具有重要作用。然而，大豆异黄酮的合成调控机制复杂，其调控网络尚未完全阐明。
10月25日，南京农业大学喻德跃教授团队在Plant Biotechnology Journal上发表了题为‘GmMYB4 Positively Regulates Isoflavone Biosynthesis via the GmMAPK6-GmMYB4-MBW Module in Soybean’的文章，研究通过GWAS分析鉴定到调控大豆异黄酮合成的关键转录因子GmMYB4，并揭示了其通过GmMAPK6-GmMYB4-MBW模块正向调控大豆异黄酮合成的分子机制。
译名：GmMYB4通过GmMAPK6-GmMYB4- MBW模块正向调控大豆异黄酮合成
期刊：Plant Biotechnology Journal
IF：10.5
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异黄酮是大豆中一类重要的次生代谢产物，其合成属于苯丙烷代谢途径的一个分支，其关键酶基因如IFS（异黄酮合酶）和ANS（花青素合酶）竞争共同前体物质，形成代谢分支。MYB转录因子在植物次生代谢中扮演关键角色，尤其在调控类黄酮和异黄酮合成中具有核心地位。然而，大豆中MYB转录因子如何精确调控异黄酮合成，尤其是其与其它蛋白复合物之间的互作机制，尚不清晰。
1. GWAS鉴定关键调控因子GmMYB4
通过对219份大豆种质在三个环境下的异黄酮含量进行全基因组关联分析，在11号染色体上定位到一个与大豆异黄酮含量显著相关的位点qGlc11，并从中筛选出候选基因GmMYB4（图1）。该基因属于R2R3-MYB转录因子家族，与拟南芥AtMYB4同源。
图1 大豆GLC相关位点的鉴定与分析
2. GmMYB4正向调控异黄酮合成
进一步的单倍型分析发现，GmMYB4存在三个主要单倍型，其中GmMYB4H1为优势单倍型，具有该单倍型的大豆异黄酮含量显著更高。组织表达分析显示GmMYB4在花中表达最高。亚细胞定位证实其定位于细胞核，符合转录因子特征（图2a-d）。进一步利用毛根转化系统进行功能验证，发现过表达GmMYB4能显著提高异黄酮含量，而RNA干扰则降低其含量（图2e-h），初步证实GmMYB4是调控大豆异黄酮积累的关键正向调控因子。
图2 GmMYB4基因的单倍型分析与初步功能验证
3. GmMYB4调控异黄酮与花青素代谢平衡
此外，研究者还构建了GmMYB4过表达株系和敲除突变体，发现过表达株系的异黄酮总含量及各组分含量（TIC、GEC、DAC、GLC）显著高于野生型，而敲除突变体则导致异黄酮含量显著降低，证明GmMYB4是异黄酮合成的正向调控因子（图3a-b）。
PS：大豆基因组中存在GmMYB4的同源基因Glyma.12g032200，双基因敲除突变体表现出更显著的异黄酮含量下降，尤其是GLC含量下降达97%，说明GmMYB4及其同源基因在异黄酮合成中具有功能互补性，进一步确认了GmMYB4在异黄酮合成中的正向调控作用。
图3 GmMYB4调控异黄酮含量及苯丙烷代谢途径相关基因的表达水平
转录组分析显示，GmMYB4过表达株系和敲除突变体中的差异表达基因显著富集于苯丙烷代谢、类黄酮和异黄酮合成通路。RT-qPCR验证发现，多个异黄酮合成关键基因在过表达株系中上调，而在突变体中下调。值得注意的是，花青素合成关键基因GmANS3的表达趋势与异黄酮合成基因相反，且花青素含量在过表达株中下降，在突变体中上升（图3c-m），表明GmMYB4在促进异黄酮合成的同时抑制花青素代谢，调控两者之间的代谢平衡。
4. GmMYB4通过干扰MBW复合体间接调控异黄酮合成
为挖掘GmMYB4的转录调控机制，研究者利用DAP-seq技术鉴定到GmMYB4的核心结合基序Motif1（5′-CACCTAAC-3′），并通过EMSA验证了其特异性结合能力。通过整合DAP-seq与RNA-seq数据，筛选出1477个潜在靶基因，KEGG富集分析显示这些基因显著富集于类黄酮生物合成通路（图4）。
图4 通过DAP-seq与RNA-seq分析GmMYB4的全基因组结合位点及靶基因
然而，酵母单杂交实验表明，GmMYB4并不直接结合上述多个异黄酮合成基因的启动子。氨基酸结构分析发现，GmMYB4蛋白包含一个典型的bHLH转录因子结合域，提示其可能通过蛋白互作发挥作用。通过LCI、BiFC、Y2H、双荧光素酶报告实验证实，GmMYB4能与bHLH转录因子（如GmTT8、GmGL3、GmEGL3）直接相互作用，这种互作干扰了经典MBW复合体（GmMYB115–GmTT8–GmTTG1）的形成，从而间接解除MBW复合体对异黄酮基因GmIFS2的抑制，并削弱其对花青素基因GmANS3的激活，实现对异黄酮与花青素代谢流的平衡调控（图5）。
图5 GmMYB4通过与bHLHs互作干扰MBW复合体的形成
5.GmMAPK6通过磷酸化与转录激活调控GmMYB4
团队进一步研究了GmMYB4的上游调控机制。结合生信预测与BiFC、Co-IP、Y2H等蛋白互作实验证明，GmMYB4与丝裂原活化蛋白激酶GmMAPK6存在物理相互作用。体外磷酸化实验和质谱分析发现，GmMAPK6够特异性磷酸化GmMYB4蛋白的第39位丝氨酸残基。在毛根中过表达GmMAPK6，不仅能上调GmMYB4本身的转录水平，还能激活下游异黄酮合成基因，导致异黄酮含量的显著提升（图6）。这揭示了MAPK信号通路通过转录及翻译后双重修饰激活GmMYB4，从而正向调控异黄酮生物合成的完整链条。
图6 GmMAPK6可磷酸化GmMYB4，上调GmMYB4及异黄酮合成基因的表达并提高异黄酮含量
本研究揭示了GmMAPK6-GmMYB4-MBW模块调控大豆异黄酮生物合成的分子机制：上游GmMAPK6通过磷酸化修饰激活核心转录因子GmMYB4；随后，GmMYB4通过竞争性结合bHLH因子，干扰MBW复合体的正常组装，从而解除对异黄酮合成基因的抑制，并抑制竞争性花青素通路，最终精确导向异黄酮的高效积累。该研究为大豆异黄酮合成的复杂调控网络研究提供了关键理论依据。
图7 GmMAPK6-GmMYB4-MBW在调控大豆异黄酮含量中的作用模型
本文的研究思路极具参考与借鉴价值：
1. 精准定位：GWAS分析锁定“关键转录因子GmMYB4”；
2. 功能验证：过表达/RNAi/CRISPR，在毛状根及稳定植株中验证表型；
3. 机制深挖：
下游靶标验证：RNA-seq + DAP-seq、酵母单杂，发现GmMYB4不直接结合结构基因启动子；
蛋白互作：Y2H、BiFC、LCI等蛋白互作技术证实GmMYB4通过竞争性干扰MBW复合物组装；
信号传导：磷酸化修饰验证、激酶-底物关系解析，串联完整的信号通路。
创新点：研究发现并阐明了一个全新的“竞争性干扰”调控模型：GmMYB4并不直接结合下游基因的启动子，而是通过竞争性结合bHLH转录因子（GmTT8），干扰MBW复合物形成，间接解除对异黄酮合成基因的抑制，重新编程代谢流向。
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