ATAC-seq，是2013年由斯坦福大学 William J. Greenleaf 和 Howard Y. Chang 实验室开发的用来研究染色质可及性（通常也理解为染色质的开放性）的方法。该技术通过转座酶对特定时空下开放的核染色质区域进行切割，获得在该时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。因此，ATAC-seq得到的是全基因组尺度上处于开放状态的染色质区域，并且通过分析染色质开放区域的motif可以获得潜在的活跃转录因子及其靶基因。
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※全基因组的染色质可及性
ATAC-seq的核心是直接鉴定基因组中的开放区域。染色质开放是基因转录活跃的前提。一次独立的ATAC-seq实验就能提供一幅全基因组范围的“染色质可及性图谱”，可以定位潜在的调控元件包括启动子、增强子、绝缘子等;
※识别潜在的TF motif
通过在开放的染色质区域中搜索富集的DNA结合基序以及TF footprint分析，可以推测哪些转录因子可能参与调控；
※揭示核小体位置与染色质高级结构
由于Tn5转座酶难以切割被核小体紧密包裹的DNA，产生的片段会呈现出以~200bp为周期的周期性分布。这可以用来在全基因组范围内绘制核小体的精确位置。通过分析启动子、增强子等区域的核小体占据情况，可以判断其活性状态（例如，活跃的启动子通常具有典型的“核小体缺失区”）。将染色质可及性与核小体排布联系起来，可为理解表观遗传调控机制提供更深层次的视角。
※敏感捕捉“先导变化”
比如药物处理后、基因敲除/过表达后、细胞分化前后、应激、环境变化等，遵循染色质开放→转录因子结合→基因转录（RNA变化）的生物规律，ATAC-seq能捕捉到调控区域的早期变化，比RNA更提前告诉我们哪些基因即将被激活或沉默。
※联用思路一：ATAC-seq+转录组
路径一：先RNA-seq初筛通路，后ATAC-seq解析表观调控
先通过 RNA-seq 对比处理组与对照组的差异表达基因（DEGs），结合功能富集分析（GO/KEGG）锁定核心生物学通路；再对相同样本进行 ATAC-seq，检测全基因组染色质可及性差异，重点分析RNA-seq锁定通路中DEGs的启动子/调控区可及性变化；通过motif富集分析识别差异可及区域的转录因子结合位点，明确表观调控关键因子；最后结合功能实验，确认“处理因素→染色质可及性变化→基因表达→生物学表型” 的调控链。
路径二：先ATAC-seq定位开放区域，后RNA-seq关联功能
先通过ATAC-seq 检测处理组与对照组的差异染色质可及区域，对差异peak进行基因注释，初步定位可能受表观调控的候选基因；再通过RNA-seq筛选 DEGs，利用Venn 图、九象限图等工具，分析ATAC-seq注释基因与RNA-seq DEGs的交集，对交集基因进行功能富集，明确核心通路；最后通过分子实验和表型验证交集基因的功能及调控机制，确保研究结果的准确性。
案例一
文章题目：Integration of ATAC-Seq and RNA-Seq Reveals the Role of FaTIP1 in Red Light-Induced Fruit Ripening in Strawberry
期刊：International Journal of Molecular Sciences（Q1,IF=4.9）
发表时间：2025.01
研究内容：红光如何通过调控基因表达促进草莓成熟，通过ATAC-Seq+RNA-Seq联合分析确定“红光特异诱导、且能调控成熟”的关键基因FaTIP1
文章取红光照射15天后转红的草莓果实进行ATAC-Seq（n=2)和RNA-Seq（n=3）联合分析，与对照组（黄绿光照射，不促成熟）相比，ATAC-seq显示红光组特有的染色质开放基因显著富集于碳代谢通路和内吞作用通路；RNA-seq显示上调DEGs主要参与“淀粉蔗糖代谢、半乳糖代谢”等通路。交叉“红光组特异峰基因（ATAC-seq）”与“红光组上调基因（RNA-seq）”，筛选出3个核心候选基因：FaTIP1（液泡膜水通道蛋白）、FaQKY（跨膜蛋白）、FaLBD1（器官发育调控因子）。最终通过qRT-PCR和草莓果实瞬时转化验证FaTIP1是红光促进成熟的关键基因。
※联用思路二：ATAC-seq+转录组+CUT&Tag
对同一时间点、同一批次样本同步开展ATAC-seq与RNA-seq：ATAC-seq识别差异开放/关闭区域、注释到附近基因推测哪些基因受调控、做motif分析预测可能参与的转录因子；RNA-seq获得差异表达基因，将两者数据交叉分析，筛选开放增强的基因（↑表达）或开放下降的基因（↓表达），并预测候选转录因子。
ATAC-seq检测染色质是否开放，但无法得知开放区域是否正在被使用（活跃转录或增强子活性），还需要活性组蛋白标记（H3K27ac/H3K4me3）和/或 TF 结合等功能因素。对同批次样本进行CUT&Tag分析：
①这个开放区域到底是什么性质的“功能区”？→组蛋白修饰CUT&Tag
组蛋白修饰＝染色质状态的“功能标签”，不同标记代表不同意义
CUT&Tag加组蛋白修饰后可以确认开放区域是“真正活跃的转录元件”还是“仅仅开放但不活跃的潜力元件”，后续验证实验关注的也是当前正在驱动基因表达的真实调控位点。
②验证TF的真实结合位点→TF CUT&Tag
选择候选TF（来自ATAC-seq的motif 预测), CUT&Tag获取TF的真实结合 Peaks，Peaks注释到基因启动子/增强子，确认靶基因，并整合三组学分析数据构建TF-靶基因-通路调控网络。最后通过功能验证和表型观察，确认机制生理意义。
案例二
文章题目：Uncovering the transcriptional regulatory network involved in boosting wheat regeneration and transformation
期刊：Nature Plants（Q1,IF=13.6）
发表时间：2023.06
研究内容：聚焦小麦再生与遗传转化的转录调控机制，通过RNA-seq+ATAC-seq+CUT&Tag多组学分析鉴定关键调控因子并验证其功能，核心是构建小麦再生的转录调控网络并挖掘高效转化增强子
小麦幼胚盾片被转移到愈伤诱导培养基开始培养，研究设置5个关键再生阶段（DAI=0/3/6/9/12，DAI=诱导天数），每个时间点采集相同的幼胚盾片/愈伤组织样本，分成三份分别用于RNA-seq、ATAC-seq、CUT&Tag分析。RNA-seq鉴定出40,146个差异表达基因；ATAC-seq通过“足迹分析”从开放峰中识别出再生相关转录因子的结合位点；CUT&Tag聚焦3种关键修饰（抑制性H3K27me3、启动子激活修饰H3K4me3、增强子激活修饰H3K27ac）揭示“抑制-激活”的修饰状态。最后整合三组学数据明确再生过程的调控先后逻辑并构建小麦再生的核心转录调控网络：
第一步：组蛋白修饰调整：H3K27me3从靶基因区域去除，同时H3K4me3/H3K27ac开始富集；
第二步：染色质可及性变化：修饰调整后，靶基因调控区染色质开放
第三步：基因表达响应：染色质开放后，TF结合并启动基因表达；
核心TF的调控逻辑：TaWOX11/TaDOF5.6（再生启动）先激活→触发TaBBM/TaAIL5（愈伤形成）→再激活TaWOX5/TaLBD17（早期分化-晚期分化），形成“时序性调控级联”，推动再生进程
※联用思路三：ATAC-seq+转录组+Hi-C
染色质在三维空间中会折成很多小圈（loop），一串圈组成一段“相互接触更频繁”的区域（TAD），由于基因调控是立体的，所以即使基因和增强子在基因组序列上线性相距很远（＞50kb），只要它们被折叠到同一个loop/TAD，就能轻松接触并调控。我们做完ATAC-seq分析后只能看到一个区域开放，但并不能说明这个开放的区域到底调控哪个基因，它可能离最近的基因很远。而Hi-C的结果会告诉我们增强子X在空间上联系的是基因B，而不是线性距离上最邻近的基因A。再比如说某基因M上调了（RNA-seq），但它的启动子没有开放变化，它附近也没新的增强子开放（ATAC-seq）, 我们可能会以为数据错了。但通过Hi-C数据一看：远处一个增强子（＞30kb）新建了一个 loop环，连上了基因M，因此它上调了。
如果想做更深层的调控网络/机制，可以用RNA-seq定位“变化的功能基因”；ATAC-seq揭示“开放的调控区域”；Hi-C判断“增强子与基因是否在3D空间接触”。通过三者联合分析可对“3D结构变化+可及性变化+表达变化” 的共调控基因进行功能富集，锁定核心靶基因。
案例三
文章题目：Dynamic 3D chromatin organization and epigenetic regulation of gene expression in peanut nodules
期刊：Journal of Integrative Plant Biology（Q1,IF=9.3）
发表时间：2025.10
研究内容：解析花生根瘤形成与共生固氮过程中染色质三维结构和表观遗传修饰对基因表达的调控机制
研究选用花生根（1周龄）和接种根瘤菌30天后的根瘤组织，分别构建Hi-C、ATAC-seq、RNA-seq 的测序文库。先通过Hi-C解析根和根瘤的3D基因组结构，检测染色质环差异（如根瘤中特有的 H3K27me3介导的环）；在Hi-C确定的“结构变化区域”内，通过ATAC-seq 鉴定开放染色质区域；最后通过RNA-seq的差异表达基因数据，将“结构变化“开放染色质区域”与“基因功能”关联：找到根瘤中富集的DEGs（如AhNINa、AhMsrA），并检查这些基因是否位于Hi-C发现的“活性A区”或“结瘤特异性染色质环”内，验证开放区域与基因表达的相关性（如根瘤特异性LoOCRs 附近的基因，表达量显著高于无开放区域的基因）。
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