北大张力勤团队新研究登Nat Biomed Eng，予路乾行提供分子动力学模拟与计算支持

在分子生物学与生物医学检测领域，如何实现对特定目标分子的快速、灵敏且无需复杂操作步骤的检测，一直是研究人员追求的目标。传统的免疫分析法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫荧光，虽广泛应用却依赖多步洗涤和信号放大，不仅操作繁琐，还难以用于活细胞或微小样本中的实时监测。尽管核酸适体（aptamer）因其易合成、易修饰等优势被视为抗体的有力替代物，但如何高效地获得兼具高亲和力与目标诱导型构象变化功能的“智能”适体探针，仍是一个严峻挑战。

该研究报道了一种基于微珠展示与荧光激活分选（FACS）的系统性功能化筛选策略，能够直接从随机文库中筛选出荧光响应型适体信标，实现对多种蛋白质靶标（包括细胞因子、膜蛋白等）的高性能、“免洗涤”检测。该信标在发夹结构的茎部两端分别标记荧光基团与淬灭基团，初始状态下因荧光共振能量转移（FRET）而处于荧光猝灭状态。当与靶蛋白结合时，信标发生构象变化，茎环打开，荧光恢复，从而实现“信号开启”式检测（图1）。这项技术旨在解决传统免疫检测方法中操作繁琐、准确性差、难以实现实时动态观测的瓶颈，为生命科学研究和医学诊断提供了新一代强大工具。

图1 - 适体信标文库构建与系统功能筛选流程示意图

研究团队首先在微珠表面构建发夹型DNA文库，该结构在茎部嵌有荧光基团与淬灭基团，初始状态荧光关闭。通过乳化PCR获得单克隆微球文库，再经酶切、延伸及变复性处理，最终获得可用于目标结合诱导荧光激活的候选信标。研究团队以细胞因子IL-2和膜蛋白HER2为模式靶标，通过数轮FACS分选与测序分析，成功富集得到多个高亲和力、高信噪比的适体信标。

表征结果显示，所得IL-2适体信标（如AB-I2、AB-I5）具有纳摩尔级亲和力（Kd=67nM及131nM），并在结合靶标后表现出显著的荧光恢复效应。其在溶液相检测中展现出宽动态范围（195pM–800nM）及低检测限（7.24 pM），性能与商品化ELISA试剂盒相当，但无需洗涤步骤。此外，该信标可有效区分活化与非活化Jurkat细胞，并对细胞分泌IL-2实现定量分析。值得注意的是，该适体信标可经转染进入活细胞，实现细胞内IL-2的实时动态监测。

针对HER2的适体信标（如AB-H10）同样在细胞膜表面及外泌体中展现出良好的特异性与浓度依赖性响应（图2）。予路乾行自研的DIVAMICS分子动力学平台，基于第一性原理与多尺度分子动力学，可以模拟数十纳秒到毫秒级别的蛋白质结构和靶点结合模式的动态变化，突破了传统人工智能仅能解析蛋白质静态图像的局限。在本文研究中，研究团队采用通过分子动力学模拟，研究进一步揭示了HER2信标与靶标结合后发生的构象变化及茎环解离机制，阐明其荧光激活的结构基础。

图2 - 膜蛋白HER2适体信标的免疫分析应用

予路乾行首创的“分子电影”技术，借助DIVAMICS平台把药物分子与靶点相互作用的全过程以动态影像方式呈现，帮助研究人员发现传统静态结构无法揭示的结合模式与构象变化。

该平台具有良好的通用性，可扩展至其他靶标蛋白，如PD-L1、GPC-3、IFN-γ与TNF。稳定性研究表明，所选适体信标在生理条件下具备良好的稳定性与较长的半衰期。尽管在亲和力与开关效率的平衡、以及复杂基质中的应用仍面临挑战，本研究为开发新一代“无洗涤”生物传感探针提供了标准化、高通量的筛选范式，对推动细胞内实时成像、微流控诊断及蛋白质组学分析具有重要意义。

研究团队指出，该标准化平台不仅能简化适体信标的筛选流程，还可大幅提升效率和一致性，从而推动新一代靶标响应型适体的发展。这些信号开启型（signal-on）适体有望实现复杂环境中的实时检测，拓展至细胞内成像、微流控分析等领域。此外，它们在电化学检测、DNA计算等依赖构象切换的检测方式中也展现出潜在价值。未来，这类高度一致化的信号型探针还可应用于超高通量多重检测（ultra-high multiplexing）和蛋白质组学，为生命科学研究和先进诊断技术提供新工具。