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李珊 范自全
药物临床实验失败的主要原因包括靶点验证不足、疗效缺乏以及脱靶导致的毒副作用等。因此，现代药物开发不仅要求生物活性分子能够调节疾病表型，还应明确其分子靶标。化合物、靶点和表型可视为临床前药物发现过程的三要素[1]。对于活性分子的未知作用靶点或潜在脱靶效应发现，通常需要通过高通量筛选的方法开展。由于90%以上的药物靶点为蛋白质，因此基于质谱的蛋白质组学可在药物靶点早期发现方面发挥重要作用。
图1. 基于质谱的蛋白质组学在临床前药物发现过程中的应用[1]（点击查看大图）
目前，利用蛋白质组学进行靶点发现的方法大致可以分为两种：基于衍生化修饰的化学蛋白质组学技术和利用化合物结合对蛋白质结构和生物物理特性的影响进行分析的方法。
基于衍生化修饰的化学蛋白质组学方法需要首先对目标化合物设计和连接某种探针分子[2]，再根据探针特点设计实验将与化合物结合的蛋白进行富集。该方法存在的问题是前期开发周期较长，探针可能影响化合物活性构象，有些化合物修饰难度较大。
图2. 基于衍生化修饰的化学蛋白质组学技术[2]（点击查看大图）
利用化合物结合对蛋白质结构和生物物理特性的影响进行分析的方法无需对配体进行化学修饰，包括LiP-MS (蛋白有限水解质谱)、TPP (热蛋白组分析)、SPROX (蛋白质氧化速率稳定性技术)、TRAP (靶向响应可及性)等。
其中，Lip-MS[3]的设计原理基于蛋白与配体结合后，暴露不同的广谱蛋白酶酶切位点，产生不同的蛋白酶切片段。中科院大连化物所叶明亮团队开发的PELSA[4]方法可同时高灵敏鉴定配体结合蛋白和结合位点，近期还入选了首届“中国蛋白质组学十大进展”。
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TPP[5]的设计原理是利用蛋白随温度升高发生降解，当结合药物后，相同温度下未降解蛋白的量会提高，该复合蛋白的热熔曲线会右移。该方法还可用于活细胞水平的药物靶点筛选。Gaetani[6]等在TPP的基础上，开发了PISA方法，将不同温度处理的样品混合后定量检测，极大降低了样本检测数。每种药物靶点筛选方法都有各自的优势和不足，需根据应用场景选择适合的一种或多种方法结合分析。
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由于很多靶标蛋白在体内含量较低，且蛋白与配体结合后可检测的变化差异往往也较小，这就需要后续的质谱检测方法提供尽可能高的蛋白检测灵敏度和定量准确性。以PISA为例，该方法虽然极大简化了TPP实验流程和样本量，但由于将不同温度点样本合并，ΔSm反映出的定量差异往往更小。因此，以往检测常采用TMT标记后分多个馏分，再对每个馏分进行长梯度LC-MS分析。TMT标记对于不熟悉蛋白组学样品前处理的研究者来说还是具有比较大的挑战。近年来，随着质谱技术和AI算法的进步，DIA采集和分析策略方面都取得了进展。尤其是Orbitrap Astral质谱仪，可实现2-Th窄窗口式数据非依赖性采集(nDIA)，在蛋白质组鉴定深度、数据完整性、定量精度和通量方面都表现优异。
我们以具有明确靶点的药物甲氨蝶呤(MTX)为例进行了Astral PISA-DIA测试，分别将DMSO或2mM MTX与人胰腺癌细胞系PANC-1裂解液孵育，并在45-60℃范围内进行6个不同温度加热处理，合并加热后样本，转移上清进行常规label free蛋白组学前处理，之后通过23分钟梯度的Astral nDIA方法进行检测；各组设置3个重复。本次测试使用DIA-NN软件分析，共定量7380个蛋白组；以差异倍数(FC) 1.5、p＜0.05阈值，共筛选出248个上调和368个下调蛋白；MTX的已知靶点DHFR显著性变化在本次测试中也明确鉴定到。
与传统PISA-TMT相比，Astral PISA-DIA显著简化了样本制备流程，并在极大缩短检测时间的前提下可得到理想的鉴定结果。这也将使实际研究中进行不同药物浓度和加热温度等实验条件对比优化更加便捷。
图7. Orbitrap Astral PISA-DIA测试结果 （点击查看大图）
在蛋白质组学发现方面，Orbitrap Astral展示出强大的检测通量和覆盖深度，已使开展大规模的临床样本检测、发现新的潜在生物学标志物成为可能，助力疾病诊断更精准。在药物早期发现阶段，结合多种靶点发现方法和Astral的优异性能，也将更好的助力新化合物靶点发现、药物新作用靶点筛选、脱靶风险评估等研究，进而加速整体药物研发进程和降低后期临床失败风险。
图8. Orbitrap Astral助力药物靶点发现研究（点击查看大图）
参考文献：
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