可能有改变，也许没有
（如果依旧不理解，那就坚持不理解）
一、ModFit LT™软件介绍
ModFit是由某国某公司开发的一款DNA含量分析的专业软件，它通过对DNA含量直方图的曲线拟合，可用于计算不同细胞周期各时相（G1、S、G2/M）细胞的百分比、测量肿瘤细胞的DNA指数（DNA Index），以及分析凋亡细胞中亚二倍体的比例。
ModFit LT™ 已发展到6.0版本，据传其分析引擎经过了“数千个样本的训练”，功能日益强大。它被认为是DNA细胞周期分析领域的“专业”软件，尤其是处理复杂DNA含量数据方面，因其准确性、灵活性和自动化能力而受推崇。
当然，ModFit LT™是一款付费软件。不同版本ModFit LT™的分析步骤与操作界面有所差异。本次的操作教程示范以ModFit LT™3.1为例，分析时建议使用更高版本的ModFit LT™（或者更高版本的Flow Jo），可获得更多的参数调节机会，同时也便于操作。
二、数据分析（ModFit LT™3.1）
1.按提示打开流式原始数据：选择要分析的参数PI-A，点击OK。
图一、选择分析指标PI-A！
2.点击Define Gate1，选择FSC-A和SSC-A，点击OK后，进入圈选目标细胞界面，圈选目标细胞群，点击OK。
图二、选择分析目标细胞群！
3.点击Define Gate2，选择FSC-A和FSC-H，圈选目标细胞，点击OK，在圈选目标细胞界面，圈选目标细胞群（单个细胞群，比例越高越好），点击OK。
图三、选择分析目标细胞群中的单个细胞群！
4.点击Define Gate3，选择PI-A和PI-W，圈选目标细胞，点击OK，在圈选目标细胞界面，圈选目标细胞群（2N~4N细胞占比越高越好），点击OK。
图四、选择分析目标细胞且为单个细胞群中的2N~4N倍体细胞！
5.以上参数设置好后，进入如下界面，点击OK即可。
图五、圈门参数设置完成界面！
6.在Mod参数下，Linearity理想状态为2（G2/G1），可根据G2和G1实际峰值在1.9~2.1范围内适当调整，其余参数不用勾选或调整；确认每个峰的位置，并将Range移动至对应的峰上；点击Fit弹出拟合与各时相比例结果，其中，RCS涉及到观测值与模型值差异的平方、数据的方差和自由度，一般在1~5之间为宜，越靠近1越好；CV主要为G1峰的变异系数，一般＜5%比较理想。
图六、拟合参数设置！
7.导出分析数据
（1）可以直接复制图片与数据粘贴至Word文档，此时文字可编辑，保留必要的信息即可，例如，进行修改样品名称、标记各时相比例等操作。
（2）或者使用“Print”功能，导出PDF，此时文字不可编辑。
图七、统一圈门逻辑批量处理数据！
三、结果解读
1. 细胞周期时相差异结果解读
（1）例1，细胞过表达细胞周期蛋白（例如，Cyclin D1）。过表达Cyclin D1质粒转染细胞48小时，G1期百分比从65%降低至45%，S期百分比从22%升高40%，G2/M期百分比基本不变。表明过表达Cyclin D1加速了细胞通过G1/S期检查点的进程，促进了DNA合成的启动，导致S期细胞比例增加。提示Cyclin D1作为一个原癌基因，可能通过驱动细胞周期进程来促进肿瘤细胞增殖。
（2）例2，血清饥饿诱导。将培养基中的血清浓度从10%降至0.5%，培养48~72小时，G0/G1期百分比从50%升到80%以上，S期百分比从30%降低至 5%，G2/M期百分比从20% 降低至10%，表明降低血清浓度剥夺了细胞增殖所必需的生长信号，迫使大部分细胞退出细胞周期，细胞成功停滞在G0/G1期。
（3）例3，DNA损伤化疗药物。用化疗药物顺铂处理某癌症细胞24小时，G1期百分比从60%降至40%，S期百分比变化不大，G2/M期百分比从15%升至 40%。表明顺铂诱导细胞发生G2/M期阻滞（DNA损伤剂的经典效应），同时可能存在Sub-G1峰，提示有细胞凋亡。
2.统一的圈门逻辑
展示如何从所有事件中圈出单细胞，并逐步展示从目标细胞群至DNA含量直方图的圈门逻辑、圈门范围。
3.DNA含量直方图
必须叠加显示拟合曲线，并清晰标注软件计算出的各时相百分比。
4.统计图表（统计学意义）
通常用柱状图展示不同处理组之间G0/G1、S、G2/M期百分比的统计对比结果（平均値±标准误，并标注显著性，*P<0.05, **P<0.01）。
5.关键参数（数据质量）
在图中标明CV值和拟合优度值（G1峰CV值越小越好、RCS值小于5；各时相细胞比例数据，静止期细胞主要分布在G0/G1期，肿瘤/分裂旺盛的细胞主要集中在S期），证明数据质量和分析的可信度。
1. 不同样品的细胞周期G0/G1峰的位置不一致
（1）G0/G1峰位置不一，主要是技术误差，而非生物学现象，核心原因是荧光绝对强度的测量受到了仪器状态、染色过程等变量的影响。这也就是为什么一直在推荐：要保持细胞密度基本一致，其余固定、染色等操作也保持一致（不同组别之间的可比较性，首先在于控制变量）。
（2）但是，只要G0/G1、S、G2/M各期的峰形能够清晰区分，并且峰与峰之间的比例关系（G0/G1峰大约是G2/M峰荧光强度的一半）正确，就可以通过后期数据分析得到准确的细胞周期分布百分比。
2.为什么在细胞周期实验中，有些样品G2期没有峰
（1）如果该样品的FSC与SSC散点图比较集中，细胞碎片极少，且G0/G1峰很标准，CV值也很小，而其他样品各个时相分布比例和形状都比较合理，可能是细胞发生了G0/G1和（或者）S期阻滞，说明该处理因素可以导致细胞周期阻滞。然而，此类情况极少出现，除非是使用了特定的细胞周期阻滞剂。
（2）另外一种情况较为常见，是细胞发生了大量死亡，死亡比例至少超过了30%（别问为什么是30%），此时主要的效应是死亡，周期阻滞本身不能杀死细胞而损伤可以。那为什么与死亡效应有关的待研究因素处理，唯独偏爱处于“4N时期的细胞”？这就要回到过去，回到初次相遇，回到细胞培养中去，回到细胞分裂和对数生长期的特点中去找寻答案……
慢慢地你就会发现：在有限剂量下，待研究因素的死亡效应，在冥冥之中都是注定的！因为，如果它真的不是这个样子了，你就观察不到这个现象了……，至此，你就会明白，为什么有些人看一眼数据，就决定一些项目，目前已经没有必要再继续做下去了：因为有些东西，它既然已经是现在这个样子了，就不能同时是其他的样子了。
1.为什么别人实验很顺利，自己的实验“命运多舛”
（1）Science是一个圈子，“观念”和“结果”正确比很多事实都重要！
（2）有时候，有些人不反驳你，可能不是因为赞同！也许觉得世界就这样：你坚信的事情在他人的认知与信念里，或许也只是“偏执的信念”！
（3）因为很多事情就像流星划过夜空那般短暂：最难改变一个人，最难放下执念。当一个人：难以认清自己的同时也很难以赢得别人信任！所以，从怀疑一切开始，先赢得自己对自己的信任，再期许改变“偏见”。
2.感觉已经很努力了，为什么实验还是不顺利？
（1）重复性的工作一般不需要天赋，努力就行；如果还不行，就是你的努力还远远不够。
（2）需要悟性的工作，很多只能意会不能言传。当你很努力了却依旧看不清事情本来的样子，或许就是悟性不够。此时此刻，光有努力和信念是远不够的，因为社会实践会让人认清现实并非纸上谈兵……
（3）热爱才是你现在的信仰，以后就不是了。如果有什么是现在不够热爱了的，那就不爱了吧！你的这一生大概、也许有几万个日日夜夜，我想你依旧是找不到三个非要强制这样做，或那样做的不可抗拒的理由。
你看，天黑了
现实生活中，到底什么话才能让人醍醐灌顶？
根本没有，唯有自己三撞的南墙！