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1. 化验管可能偶尔泄漏并在Cobas Liat分析仪中造成光路阻塞，从而导致PCR生长曲线异常。这可能会导致无效或错误的阳性结果，特别是对于B型流感检测而言。FDA补充道，如果试管确实泄漏，随后的测试可能会增加B型流感假阳性结果的可能。
2. 反应管中异常的PCR循环可能产生异常的PCR生长曲线，从而导致假阳性。FDA表示这个问题是零星的，可能是由硬件定位，体积移动和曲线解释引起的。该问题可能对运行中的所有分析物造成误报。
这大致解释了笔者的疑惑。这也让笔者想起了之前罗氏对该产品的宣传语—We put a lab in a tube...Because they put their trust in you。只能说，浓眉大眼的罗氏，你辜负了俺们的信任。
这也给大家一个教训：产品的稳定性决定一切；而对于微流控全自动核酸检测系统，微流控耗材的量产的稳定性，特别是封接的可靠性，做好可不太容易—你看看，罗氏都马失前蹄。
但罗氏毕竟是罗氏，2021年3月15日Roche与GenMark Diagnostics（其主打产品也是微流控全自动核酸检测系统-GenMark ePlex system）共同宣布双方已就总交易价值约18亿美元现金收购事宜达成最终并购协议。
无论结果如何，该产品的微流控设计思路还是非常值得借鉴的。因此，特把我们微流控技术团队之前梳理的该产品的剖析呈现给大家。
第1章 产品概述
1.1 cobas® Liat®分析仪
电源：输入100-240V AC/50-60Hz；输出15V DC/8.6A；
尺寸：高度19.0cm；宽度11.4cm；长度24.1cm；重量3.76kg；
条码：39, 93, 128 -A & -B, Codabar, Databar-14, EAN-8, EAN-13, GS1, Interleaved 2 of 5；
环境要求：温度15~32℃；相对湿度15%~80%；海拔2000m；
数据和显示：大约可以存储20,000个带有日期和时间的测试结果(根据文件大小而不同)；支持HL7和POCT1-A的连接；PCR曲线显示；
此外，分析仪还包含样本体积检测功能以及试剂批次识别，测试管包含内部对照，能够实时监测系统的运行过程，保证检测流程正常进行。
1.2 cobas®测试管
1.2.1 cobas® Strep A
1.2.2 cobas®Influenza A/B
样本类型：鼻咽拭子；检测时长：20min；保存液：通用拭子保存液；保存条件：2~8℃；
第2章 cobas®测试管原理
2.1 cobas®测试管结构解析
2.1.1 管帽详细结构
2.1.2 试样细管详细结构
2.1.2.1内置研磨结构
试样细管不同节段内置的试剂根据实际需求有所不同，其中包含的一个节段的壁面经过韧化处理。通过挤压使得微齿状内表面沿细管的轴线方向研磨运动，实现打乱固态试样或固态环境试样的细胞团的目的。该节段的内壁面结构如下图所示：
2.1.2.2内置过滤装置
细管内还可以包含样本过滤装置216，如下图所示。
2.2 测试管检测应用场景
2.2.1 全血样本白细胞分离基因组DNA检测
1.试样的溶解：
开放第一夹具310，其他夹具关闭。制动器312挤压第一节段110以确保10uL的样本体积存在于110中，然后关闭夹具310，多余的样本进入管帽废液腔22中。
随后制动器322对第二节段施压，使PBS缓冲液和蛋白酶k混合。
夹具320开启，交替施压制动器312和322，使样本和第二节段中的缓冲液混合。
随后闭合制动器312和夹具320，使样本进入第二节段和缓冲液混合。
夹具330打开，制动器332和322交替运动，使第二节段内的样本缓冲液和第三节段内裂解液交替移动并混合，并在50℃条件下孵育5min。
夹具340打开，制动器342对第四节段施压，使异丙醇磁珠悬浮液与裂解后样本混合。
随后制动器322、332与制动器312、342交替运动，是磁珠悬浮液和样本充分混合，培养5min。
制动器332带有磁铁，能够吸附磁珠，在混合完成后，制动器332下压尽可能靠近细管节段，形成窄流道并吸附磁珠。制动器322和342交替运动，让液体两侧移动，提高磁珠的捕获效率。
随后制动器342~312，以及夹具340~310依次开启和关闭，使废液逐步运输至废液腔22中。
3.洗涤：
打开夹具350和制动器342，随后关闭制动器352，使清洗液1流入至第四节段当中。
闭合夹具350，并打开夹具340，随后关闭制动器342，使液体流入磁珠所在的第三节段。上移制动器332即可以撤销磁场。
制动器332和342交替运动以使磁珠重新悬浮。
随后332下压使磁珠重新吸附在磁铁附近，随后制动器342~312，以及夹具340~310依次开启和关闭，使废液逐步运输至废液腔22中。
清洗液2通过开启夹具360，并下压制动器362进入至第五节段中。
随后关闭夹具360，下压制动器352，使清洗液2进入第四节段中。随后关闭夹具350。
制动器332、夹具340、330上移保证较窄的间隙并形成贯穿第三节段的流体通道，随后制动器342对第四节段缓慢施压，使清洗液2以层流的方式对第三节段中的捕获磁珠进行清洗。
随后左侧有所制动器和夹具逐步开启和闭合，使废液流入废液腔22中。
4.核酸洗脱：
打开夹具370，打开制动器362，然后下压制动器372，使第七节段中的洗脱液进入第六节段。
可按照上述方法将洗脱液送入第三节段和磁珠接触。
逐步撤销磁场，随后可进行适当搅拌混合，并加热至95℃培养2min。随后制动器332下压，使磁珠重新吸附。
逐步将洗脱的样本转送至第七节段中。
制动器372适当下压排出多余的洗脱液，保留50uL洗脱样本，随后关闭夹具370.
5.核酸扩增及检测：
示例中，采用EDTA处理的新鲜人体全血样本进行了三次试验，结果如下：
2.2.2 拭子样本中分离基因组DNA检测
随后打开夹具320，挤压制动器322使缓冲液和拭子接触。
随后关闭夹具320，制动器312交替的挤压和释放，研磨拭子是试样洗脱。
拭子样本预先浸入20uL的PBS保存液中，然后搅拌悬浮试样，最后加入试样细管中10uL体积样本。
2.2.3 血浆细菌分离DNA检测
2.2.4 血浆病毒分离RNA检测
2.2.5 全血细菌分离DNA检测
2.2.6 全血病毒分离RNA检测
2.2.7 免疫磁性富集全血中细菌
2.2.8 免疫磁性富集全血中病毒
2.2.9 人DNA多倍体分型检测
2.2.10 活细菌孢子的分离和萌发
2.2.11 固态组织试样人DNA多倍体分型
2.2.12 从全血中进行血浆分离及病毒检测
通过将第一节段分为两个子节段，其一用于容纳全血样本，其二预置注入凝血剂或干性多价抗红细胞抗体。第二子节段中还可以包含滤袋，孔径1um~10um，用于过滤血细胞，仅允许血浆通过。
2.2.13 棉质基质上全血分离和检测基因组DNA
试样细管可简化为四个节段。
2.3 测试管的其他扩展结构
测试管的外部固定模块中还包含固定磁铁430，以及检测装置472。其运行逻辑同2.2.1
2.3.1 空气分析测试管
需要过滤时，通过压缩节段203使清洗液突破封口74，并进入过滤节段201中，并通过过滤器205，并突破后续封口74，进入节段202执行后续的处理。空气输入和流出的过滤结构两侧的入口和出口，过滤结构能够过滤空气中的测试组分，随后通过压缩1中的萌发溶液进行洗脱。
2.3.2 核酸、蛋白正交试验
示例：样品中蛋白质毒素和细菌DNA检测
测试管具有两个加样口，用于检测食物样本中的细菌霉素和细菌，具体测试管结构如下。样品在加入前优先在外部进行过滤，从而分离细菌细胞核游离毒素蛋白。
第3章 cobas®测试管性能分析
3.1 SARS-CoV-2 & Influenza A/B测试管性能概述
3.1.1 测试管预置试剂组分
试剂类型 |
试剂组分 |
内部过程质控 |
Tris buffer，tween-80，polyethylene glycol，EDTA，< 0.001% stock bacteriophage MS2 (inactivated)，0.002% carrier RNA，0.01% ProClin® 300 preservative |
蛋白酶k |
100% Proteinase K |
磁珠 |
Magnetic Glass Particles |
裂解液 |
Citric acid，sodium phosphate，42.6% guanidinium isothiocyanate，5% decaethylene glycol monododecyl ether，dithiothreitol |
清洗液 |
Glycine, potassium fluoride，0.01% ProClin® 300 preservative |
洗脱液 |
Trehalose，tris buffer，magnesium sulfate，bovine serum albumin， 0.01% ProClin® 300 preservative |
PCR反应Mix-1 |
Tween-80，tris buffer，trehalose，potassium chloride，bovine serumalbumin，dATP，dCTP，dGTP，dUTP，0.01% ProClin® 300 preservative，< 0.001% DownstreamSARS-CoV-2, Influenza A, Influenza Band Internal Process Control primers |
PCR反应Mix-2 |
Tween-80，tween-20，tris buffer，glycerol，potassium chloride，EDTA，dithiothreitol，< 0.01% Z05 polymerase with aptamer，0.23% MMLV Reverse Transcriptase |
PCR反应Mix-3 |
Tween-80，tris buffer，EDTA，trehalose，potassium chloride，bovine serum albumin < 0.001% upstream SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza Band Internal Control primers，< 0.01% fluorescent-labeled SARS CoV-2, Influenza A, Influenza Band Internal Control probes，0.004% Taq DSC 2.0 DNA polymerase，0.01% ProClin® 300 preservative |
3.1.2 质控品组分
试剂类型 |
试剂组分 |
体积/kit |
阳性对照SARS-CoV-2 (+) C |
Tris buffer，EDTA，< 0.003% Poly rA(synthetic)，< 0.01% non-infectious plasmid DNA (microbial) containing SARS-CoV-2 sequence，< 0.05% sodium azide |
3×0.25 mL |
阳性对照FLU A/B (+) C |
Magnesium chloride，polyethylene glycol,bovine serum albumin，phosphate buffer saline，< 0.01% Poly rA (synthetic)，5% non infectious Influenza AH1 stock and 1% Non infectious Influenza B stock (micro-organism purified and chemically inactivated)，< 0.01% ProClin® 300 preservative，Phenol red |
3×10 µL |
UTM稀释液FLU A/B (+) C |
N/A |
3×0.3 mL |
3.2 SARS-CoV-2非临床性能分析
3.2.1 灵敏度（检出限）
病毒株 |
浓度 [TCID50/mL] |
浓度 [copies/mL] |
测试数 |
准确率 [%] |
平均Ct |
USA-WA1/2020 (stock concentration 3.16E+06 TCID50/mL) |
0.048 |
49 |
10 |
100 |
32.6 |
0.024 |
24 |
20 |
100 |
33.5 |
|
0.012 |
12 |
20 |
100 |
35.2 |
|
0.006 |
6 |
20 |
75 |
35.9 |
|
0.003 |
3 |
20 |
25 |
36.7 |
3.2.2 反应性/包容性
靶标 |
RdRp gene (ORF1ab) |
N gene |
||||||
数据库 |
NCBI |
GISAID |
NCBI |
GISAID |
||||
序列数量 |
3552 |
100% |
27350 |
100% |
3342 |
100% |
27175 |
100% |
突变序列 |
51 |
1.44% |
119 |
0.44% |
23 |
0.69% |
142 |
0.52% |
未检测序列 |
0 |
0.00% |
0 |
0.00% |
0 |
0.00% |
1 |
0.004% |
3.2.3 交叉反应性
病毒株 |
N同源百分比 |
RdRp同源百分比 |
||||
正向引物 |
探针 |
反向引物 |
正向引物 |
探针 |
反向引物 |
|
人类冠状病毒HKU1 |
81.50% |
|||||
SARS-coronavirus (SARS-CoV-1) |
100.00% |
81.48% |
94.74% |
95.80% |
87.50% |
96.30% |
冠状病毒MERS |
80.00% |
|||||
流感嗜血杆菌 |
95.00% |
|||||
嗜肺军团菌 |
80.00% |
|||||
酿脓链球菌 |
80.00% |
|||||
肺炎支原体 |
83.30% |
|||||
白色念珠菌 |
90.00% |
83.30% |
||||
表皮葡萄球菌 |
85.00% |
|||||
· 人类冠状病毒229E/OC43/NL63 |
无匹配结果 |
|||||
· 腺病毒(如C1和71) |
||||||
· 人类偏肺病毒(hMPV) |
||||||
· 甲流 |
||||||
· 乙流 |
||||||
· 肠病毒（如EV68） |
||||||
· 呼吸道合胞体病毒（RSV） |
||||||
· 鼻病毒 |
||||||
· 肺炎衣原体 |
||||||
· 结核分支杆菌 |
||||||
· 肺炎双球菌 |
||||||
· 百日咳博代氏杆菌 |
||||||
耶氏肺孢子菌(PJP) |
||||||
绿脓杆菌 |
||||||
3.2.4 交叉反应性（SARS-CoV-1）
3.2.5 共感染（竞争性抑制）
共感染实验通过设置一个高浓度的靶标和多个低浓度的靶标，并进行梯度稀释。这些实验室为了确定高浓度靶标样本是否会对低浓度的靶标样本产生竞争性的抑制。低浓度一般定义为3×LoD，高浓度靶标对应的Ct值可以在20~24或12~16。样本进行梯度稀释直至低浓度检出率<100%。拷贝数浓度通过RT-ddPCR进行测定。
3.3 SARS-CoV-2临床性能分析
3.4 Influenza A/B非临床性能分析
3.4.1 灵敏度（检出限）
检出限的测定采用3种Influenza A病毒株和2种Influenza B病毒株，具体如下：
病毒株 |
LoD (TCID50/mL) |
A/Brisbane/10/07 |
2.0 × 10-2 |
A/Brisbane/59/07 |
2.0 × 10-3 |
A/NY/01/2009 |
2.0 × 10-2 |
B/Florida/04/06 |
2.0 × 10-3 |
B/Malaysia/2506/04 |
4.0 × 10-3 |
3.4.2 重现性
重现性研究分析了不同操作人员、研究地点、测试天数、分析器和测试管批次之间检测甲型流感/乙型流感的检测差异。3个地点各有两名操作员分别在5天内，每天测试了10人份，每人份的样本重复测试三次，共计约900个结果。测试管分为三个批次，分别采用9台仪器进行测试。测试的Influenza A 和Influenza B分别包含高值阴性、中阳性、弱阳性以及阴性对照样本。
以下是Influenza A样本重现性的检测。
3.4.3 反应性/包容性
反应性研究评估了流感毒株的时间和地理多样性的检测能力，选用毒株和检测结果如下。从结果看，所有毒株均在检测浓度下检测到。
3.4.4 交叉反应性
交叉反应评估了鼻咽拭子样本中可能存在的非流感微生物，试验测试了人基因组DNA和35中微生物，细菌和白色念珠菌测试浓度高于106 CFU/mL，病毒测试浓度高于105TCID50/mL。结果来看，均没有检测到交叉反应现象。
3.4.5 干扰微生物
3.4.6 干扰物
潜在干扰物 |
有效成分 |
浓度 |
Mucin: bovine submaxillary gland, type I-S |
Purified mucin protein |
5 mg/mL |
血液 |
- |
5% (v/v) |
Nasal spray – Afrin |
Oxymetazoline |
5% (v/v) |
Nasal corticosteroids – Veramyst |
Fluticasone |
5% (v/v) |
Nasal gel – Zicam |
Galphimia glauca, Histaminum hydrochloricum, Luffaoperculata, Sulphur |
5% (v/v) |
Throat lozenges, oral anesthetic and analgesic –Cepacol |
Benzocaine, Menthol |
5 mg/mL |
Antibiotic, nasal ointment – Bactroban |
Mupirocin |
5 mg/mL |
Antiviral drug – Relenza |
Zanamivir |
5 mg/mL |
Antiviral drug – Tamiflu |
Oseltamivir |
7.5 mg/mL |
Antimicrobial, systemic |
Tobramycin |
4 μg/mL |
3.4.7 基质等效性
3.5 Influenza A/B的临床研究
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