小核酸药物盘点（下）：siRNA与ASO

小核酸药物是由10-30个核苷酸组成的短链核酸分子，通过碱基互补配对原理，精准调控致病基因的表达。目前，小干扰RNA（siRNA, small interfering RNA）与反义核酸（ASO,antisense oligodeoxyncleotides）为临床中小核酸药物开发的主要形式，siRNA优势在于特异性高和长效性，ASO功能多样、可穿透血脑屏障，但脱靶毒性较高、半衰期较短。

小核酸药物靶点更广泛：与传统药物相比，小核酸药物基于碱基互补配对原则以mRNA或其他RNA为靶点，作用于表达蛋白的上游过程，不受靶点成药性的限制。可以通过递送系统进入胞内发挥作用，对细胞内和细胞外的蛋白表达都可以进行调控。

小核酸开发成功率更高：根据Alnylam公司开发情况，2012年1月至2022年12月间，在公司RNAi平台下靶向生物标志物的疗法中， I期，II期，III期临床成功率都超过80%，分别达到86.7%，81.8%以及87.5%，新药开发的临床阶段综合成功率高达62%。其余靶向生物标志物的疗法综合成功率仅10.3%，全行业综合成功率仅5.7%。

与小分子化药、抗体药物相比，小核酸药物具有可选靶点多，生产研发周期短，成本低等多方面优势。核酸药物的开发曾因核酸的不稳定性、生物利用度低、递送困难等因素导致发展缓慢，但现阶段新的化学修饰和新型递送系统大大改善了核酸性质的不稳定，可成药性显著提高，近年来成为新的药物开发浪潮。

小核酸药物形式在实际应用中有多个环节需要优化以提高成药性，主要在于保持其稳定性和提高其递送效率。RNA暴露在血液中容易被血浆和组织中的核酸酶降解，且RNA因为分子量大以及带负电，难以透过细胞膜进入胞内发挥作用，需要提升内吞和内吞逃逸的几率，ASO更要解决进入细胞核的问题，因此改进方向主要为小核酸化学修饰和递送系统改进。

1）体内稳定性与亲和力，免疫原性。

裸露的核酸在人体中并不稳定，易被血液和组织中的核酸酶降解，同时也容易被肝脏和肾脏的网状内皮系统快速清除。另外外源性核酸具有免疫原性，容易引起细胞内及细胞外的免疫反应。因此需要通过化学修饰提高稳定性及底物特异性，降低免疫原性，修饰手段包括对核糖、磷酸骨架、碱基以及核酸链末端等的改进。 

第一代方法主要是利用硫代磷酸进行的主链（Backbone）修饰，可通过增加疏水性、对内切酶的抗性等来促进体内细胞摄取和提高生物利用度。

第二代修饰方法是在核糖上2’位的修饰，包括 2’-氟、2’-甲氧基等，可以提高对RNA的结合亲和力并进一步提升核酸酶抗性。 

第三代修饰则是核糖的五元环改造(Alternative Chemistries)，包括使用PNA、PMO等可以进一步增强核酸药物对核酸酶的抗性、提高亲和力和特异性。

2）细胞摄取效率。

随着前些年核酸合成与修饰技术的不断进步，目前制约小核酸药物开发与广泛应用的主要因素是递送体系的构建。

改进递送系统提高细胞摄取效率：LNP技术和GalNAc技术目前都只是基于肝脏特有的生物机制靶向递送系统，靶向其他组织或者细胞的递送技术尚未成熟。虽然还有外泌体、核酸偶联递送等新型递送方式，但高效的、可以靶向肝外器官或组织的递送方式以及内吞逃逸效率的提高仍然有待继续开发。

3）内体逃逸。

小核酸药物被内吞后难以从内涵体中逃逸，导致有效药物浓度不足，研究表明目前通过内吞作用进入细胞的小核酸内体逃逸率不足0.01%。 GalNAc递送系统的成功正是由于ASGPR在肝细胞表面特异性的高表达（~106/肝细胞）以及较快的循环速度，使得即使如此低的逃逸率也能有足够多的小核酸药物逃逸并起效。相比之下，大多数细胞表面的受体（104 –105）量级以及内吞速度（~90 min）无法支撑足够多的小核酸顺利逃逸并起效。

siRNA通过RNA干扰（RNAi）机制调节基因表达。RNAi是双链RNA（dsRNA）通过靶向互补mRNA进行降解来诱导基因沉默的生物学机制。长双链RNA被剪切为短双链RNA后，与蛋白质结合形成siRNA诱导干扰复合体（RISC），短链RNA的正义链降解后，RISC再与特定mRNA结合使之降解，沉默相应基因的表达。目前已知具有RNAi作用的RNA主要包括：siRNA、miRNA 和piRNA等，其中siRNA最受关注，发展迅速。

1. 级联放大反应与循环利用，治疗效率高

siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，会自扩增产生更多的siRNA并作用于靶mRNA，因此少量的siRNA就可以产生高效的基因沉默效果。siRNA的反义链在与靶mRNA结合后可被回收重复利用，一个siRNA分子可以驱动多个RISC降解靶标mRNA，从而产生持久的基因沉默效果，显著地延长给药时间。

2. 通过优化序列设计提升有效性

某些靶mRNA的识别位点因其二级结构高度折叠而被遮盖，致使siRNA难以识别结合，进而影响药效。为此必须设计出针对性强的序列方案，选择转录序列高度保守的同源序列作为靶点。 

3. 通过结构修饰提升安全性

通过对siRNA的结构进行化学修饰可抑制其脱靶效应，减少其对不匹配siRNA的抑制作用，另外需要降低对TLR3 、7、8等的刺激，避免免疫应答。

4. 通过递送系统优化提升靶向性

目前已发展了脂质纳米粒（LNP）、多肽纳米粒（PNP）以及 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）修饰介导等多种递送系统，但在肝外靶向、毒性、效率等还需要持续突破。

ASO（antisense oligonucleotides，反义核酸）是一种与靶基因mRNA互补的单链寡核苷酸，通常包含15-30个核苷酸。根据作用机制，可分为促进RNA降解以及通过空间位阻抑制或调节RNA表达两大类。

ASO分子量较小，具有亲水、亲脂性（两亲性），经过不同程度的修饰的ASO，可以通过被动扩散进入细胞，也可与血清蛋白结合，促进它与细胞结合被特定组织吸收。虽然进入细胞后，仅有少量甚至微量的ASO进入细胞核中，但仅仅这少量的药物却能发挥强大和持久的功效。某些文献报道，在细胞质和细胞核中，siRNA或ASO等相关小核酸药物最终可能仅有小于1%达到目标；即使小于1%药物达到目标，它所能发挥的作用也是非常强大以及持久的。因此即使ASO未采用递送载体，仅通过结构修饰，也是可以少量进入目标细胞核中，发挥疗效。

反义核酸可通过以下机制、通路达到治疗目的：  

1） 促靶基因降解机制：具有核酶的活性，直接断裂、降解致病基因； 

2） 空间阻滞机制：与致病基因结合，形成双链阻碍核糖体对其翻译、阻碍其向细胞质运输、占据结合酶的位点，中断基因表达； 

3） RNaseH 依赖机制：与致病基因结合，使其容易被核酸内切酶RNaseH识别，利用RNaseH快速降解致病基因。

目前已上市13款ASO，2款已退市，适应症聚集在罕见病和神经肌肉疾病，通过静脉注射、皮下注射和脊髓内注射给药，由于天然存在的ASO不稳定且具有不利的类药物特性，因此常选用化学稳定的裸核酸药物，包括主链PS（硫代磷酸酯）连接和核糖2′ 位置上的2′O-甲氧基乙基 (2′MOE)。

1. 靶点选择与药物设计

如何选择靶点序列找到基因上的最佳位置，提升靶向特异性是药物开发的基础，涉及靶标选择、核苷酸长度选择还有修饰问题。siRNA有两条链，需要选择合适的链装载进Argonaute2中并且靶向mRNA抑制翻译，大多在3’UTR区进行筛选。ASO的序列筛选范围更大，在比mRNA更长的pre-mRNA上筛选出成千上万个ASO分子耗时费力，需要建立高效的系统筛选。另外ASO在细胞内不同的靶向机制之间的协同性目前也不是完全清楚。

2. 药物递送

siRNA需要进入细胞质，ASO需要进入细胞质和细胞核，但是这些药物如何输送到正确位置目前还不清楚。已上市的ASO大部分采用结构修饰，少部分使用递送载体，ASO分子量较小，修饰过的ASO可以吸附于血浆蛋白，使得与细胞结合并被特定组织吸收，也可以通过被动扩散进入细胞，其中Gapmer修饰的单链在细胞中是稳定的，可以穿过细胞膜或者被自由摄取到细胞内。这其中有少量ASO进入细胞核中，虽然量少但可以发挥强力且持久的效果。ASO和siRNA天然趋向于肝，神经系统疾病和肌肉系统疾病也已成药，如何确保寡核苷酸进入细胞中的正确位置行使功能，包括进入不同细胞器、进入不同细胞类型，仍旧是现在面临的药物开发的重要挑战。

1）药物设计策略：提高药物的特异性，改善脱靶效应 

通过多种药物设计策略，如优化药物序列长度、改变靶位选择等，可以达到提高药物特异性、减少药物免疫原性以及改善脱靶效应、减少毒副反应的目的。

2） 结构修饰技术：提高药物的稳定性、改善溶解性 

为增加反义核酸对核酸酶的抗性，提高药物的稳定性、溶解性，使其药效更加持久、强劲，现有修饰技术主要分为五类：核糖骨架修饰、2'端核糖替代、5'端核酸碱基修饰、2'端核糖修饰以及核苷酸桥连。

反义核酸不易富集在靶部位，而是容易聚集在肝脏、肾脏等组织，因此会带来严重的毒副作用。目前，已上市的反义核酸药物 Defitelio、Tegsedi 和 Waylivra都曾被报道过伴有血小板降低的副作用。如何应对其毒性等安全问题是发展反义核酸的难点之一。

2016年12月，Spinraza获FDA批准上市，该药用于治疗脊髓性肌萎缩症（SMA），其中鞘内注射是 Spinraza 大获成功的关键之一。通过局部给药（鞘内）的方法，药物直接注入脑脊液中，即刻就能达到较高的药物浓度，因此在给药时能够显著降低剂量，减轻毒副作用。同时，因血脑屏障的存在，药物无法扩散至外周，且脑脊液中核酶相对较少，药物能稳定地发挥作用。

2025年9月，渤健在核酸药物递送领域持续布局，以8500万美元预付款现金收购Alcyone Therapeutics，共同推进ThecaFlex DRx™的研发，为长期重复腰椎穿刺鞘内给药提供替代方案。目前，ThecaFlex DRx™系统正与Spinraza（诺西那生钠）联合用于脊髓性肌萎缩症（SMA）患者的临床评估。

开发局部给药，不仅能够规避肝脏的首通道代谢，减轻毒副作用；同时还能将反义核酸药物保留在局部区域内以延长药物的释放时间，进一步增强药效。