从宏基因组数据中拼出一个基因组，并不意味着已经还原了微生物的真实面貌。序列是否完整、组装是否连续、核苷酸与基因组成是否准确，分别回答着不同的问题。
2025年，Deng等在iMetaOmics发表研究，以大熊猫肠道微生物样本为对象，比较PacBio HiFi、Illumina短读长、Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长及相关校正、混合组装策略。研究进一步引入同一样本中培养获得的分离株，检验宏基因组组装基因组（MAG）与实际分离基因组的一致性。PacBio HiFi在该研究中的完整度、连续性和部分准确性指标上表现突出，为需要高质量MAG的研究提供了参考。
01 研究如何开展比较？
MAG是从混合微生物群落的测序数据中，经组装和分箱重建的基因组。由于样本中可能存在近缘物种和同种不同菌株，评价MAG时，既要看完整度与污染率，也要进一步考察序列和基因组成是否接近真实基因组。
这项研究采用了三层评价：先比较完整度、污染率、连续性和rRNA等常规指标；再与NCBI中的完整基因组比较，分析核苷酸层面的系统发育关系和基因有无差异；最后，以同一样本的分离株基因组为参照，检查碱基比对比例、核心基因覆盖及系统发育位置。
研究使用的HiFi、Illumina和ONT数据分别为61.12 Gb、279.42 Gb和184.15 Gb，来自同一组样本。其中，3份HiFi混样数据分别组装，12份Illumina样本数据则独立组装。六种策略包括HiFi-only、HiFi-polished、NGS-only、NGS-ONT、ONT-only和ONT-polished；NGS在该研究中指Illumina短读长，polished组使用Illumina数据进行校正。
02 各策略获得了多少高质量MAG？
该研究将完整度≥90%、污染率<5%的MAG纳入“高质量MAG”。HiFi-only组获得31个非冗余高质量MAG，其中10个呈完整环状，另有7个仅包含一条scaffold。这里的“高质量”遵循论文的筛选标准，完整环状MAG是其中的一部分。
其余五组中，HiFi-polished获得33个，NGS-only获得57个，NGS-ONT获得61个，ONT-only获得14个，ONT-polished获得17个。作者还将六组高质量MAG按95%相似度聚类，划分为59个物种层面的簇。
NGS-only和NGS-ONT组的更高的MAG召回数量仅说明该策略在该研究条件下可回收更多的MAG；但不意味更高的单个基因组的完整性、连续性和准确性。原文也指出，Illumina组更高的数据量是MAG数量差异的重要原因之一。
03 组装质量的差异体现在哪里？
在完整度方面，HiFi-only和HiFi-polished两组均显著高于其余四组。就最长scaffold和N50而言，两类HiFi组装均显著高于除ONT-only之外的其他组；ONT-only同样表现出长读长带来的连续性优势。相关组间差异采用多重比较校正后的p值判断（p-adj<0.05）。
污染率的结果需要分组理解：HiFi两组显著低于ONT-polished和NGS-ONT，但与ONT-only、NGS-only之间未见显著差异。因此，不能将这一结果概括为HiFi在污染率上优于所有策略。
在基因完整性方面，所有HiFi相关策略获得的高质量MAG均含有至少一个16S rRNA基因，其16S rRNA基因数量也显著高于其他组。NGS-only和NGS-ONT组的scaffold数量则显著多于其他组，反映出组装结果更为碎片化。结合来看，HiFi在该数据集中的主要特点，是较高的完整度、较好的连续性，以及对rRNA等序列的恢复。
图1｜六种组装策略的MAG质量比较。A：完整度与污染率；B、C：最长scaffold与N50；D：scaffold数量；E—G：16S rRNA、总rRNA和tRNA数量；H：物种系统发育关系及各策略的MAG回收情况。B—G中字母相同表示差异不显著。
04 与参考基因组和同样本分离株有多接近？
公共数据库比较：结果随物种和指标而变化
作者选择粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）和Ligilactobacillus animalis，与NCBI中标注为完整基因组的序列进行比较。从核苷酸层面的系统发育关系看，HiFi相关MAG在粪肠球菌和L. animalis中更接近数据库完整基因组；乳明串珠菌中，HiFi和ONT相关MAG分别与数据库中的不同菌株聚为一支。
基于基因有无的主坐标分析（PCoA）显示，粪肠球菌和乳明串珠菌的HiFi相关MAG更接近NCBI参考基因组，而L. animalis的Illumina与HiFi相关结果基本重叠。这提示，平台之间的差异并非在所有物种、所有指标上都保持一致。
公共数据库中的参考菌株也未必就是样本中的菌株。与数据库参考基因组的差异，既可能来自组装误差，也可能反映真实的菌株差异。因此，仅凭“更接近参考基因组”，还不足以完全确定组装的准确性。
同一样本分离株：进一步检验组装准确性
为缩小参考菌株差异带来的影响，作者从此前用于测序的样本中分离培养粪肠球菌和乳明串珠菌，并对分离株开展全基因组测序，将其作为比较参照。
在这两个物种中，HiFi相关MAG的碱基比对比例和核心基因覆盖整体表现较好；系统发育分析也显示，至少部分HiFi组装的MAG与同样本分离株聚在同一分支。相比仅与公共数据库比较，这为原文所说的“接近分离株基因组分辨率”提供了更直接的证据。
这里需要区分读段准确性与最终MAG准确性。作者提出，近缘序列和同源片段会增加短读长组装的辨别难度，较长读段则有助于提供更多上下游序列信息。因此，读段层面的准确性，并不必然直接转化为复杂群落中最终MAG的准确性。
图2｜MAG组装准确性评估。A—C：三个物种的MAG与NCBI完整基因组的系统发育关系；D—F：基于基因有无的PCoA；G、H：与同样本分离株的碱基比对比例；I、J：核心基因覆盖；K、L：MAG与同样本分离株的系统发育关系。
05 如何理解这项研究的结论？
首先，测序数据量和分析设置并未统一。HiFi在较少总数据量下取得了多项较好的指标，值得关注；但这仍不能替代等测序量、等预算或统一流程下的比较，也不能据此推导各平台的普遍成本效益排序。
其次，同样本分离株验证集中于两个物种。混合样本中可能同时存在同种不同菌株，MAG和培养获得的分离株之间仍可能存在真实生物学差异。“接近分离株基因组分辨率”，应理解为该研究验证对象和指标下的一致性提高，而非所有MAG都与分离株完全一致。
此外，研究反映的是该研究样本、测序数据和分析流程下的结果。对于其他生态环境、群落复杂度及后续更新的测序和组装方法，仍需结合具体数据验证。
这篇文献把评价从“获得了多少个MAG”，进一步推进到“这些MAG在基因与核苷酸层面是否可信”。PacBio HiFi在该研究中的完整度、连续性和部分准确性指标上表现突出，为需要高质量MAG的研究提供了参考。
面向高质量宏基因组研究需求，柏熠科技已构建全面适配PacBio测序平台的高通量测序整体方案，可衔接样本前处理、文库构建、上机测序与生物信息分析等环节，为高质量MAG组装、物种解析及功能研究提供技术支持。
参考文献
[1]Deng F, Han Y, Li M, Peng Y, Chai J, Yang G, Li Y, Zhao J. HiFi based metagenomic assembly strategy provides accuracy near isolated genome resolution in MAG assembly. iMetaOmics. 2025;2:e70041.
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关于柏熠
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