2026 年 10 月 13 日，Alisa Khramushin、Maddalena Elia、Christian Schellhaas、Alberto Borsatto 等人在 bioRxiv 发布论文 Computational design of protein conformational landscapes for metamorphic behavior，报道了一套设计多构象蛋白的方法。研究者结合骨架生成、序列设计、结构预测与实验分析，探索如何让同一条蛋白质序列兼容两种明显不同的构象，并通过少量突变改变其折叠偏好。
这项工作主要来自洛桑联邦理工学院 Bruno E. Correia 团队，并与 Luciano A. Abriata、日内瓦大学 Francesco Luigi Gervasio、佛罗伦萨大学 Roberta Pierattelli 等研究者合作完成。作者将 RFdiffusion、ProteinMPNN、AlphaFold 和 BioEmu 接入同一套流程，再用分子动力学、核磁共振与晶体学研究设计蛋白的结构行为。
研究从 93 个天然蛋白质结构域出发，生成并筛选出 2,291 对天然与替代构象，进一步探索螺旋重排、β 链转为螺旋、螺旋转为 β 链三类变化。在深入研究的体系中，作者通过两到三处状态稳定突变调节构象偏好，并获得了多个稳定变体的实验结构。
这篇文章想解决两个相互关联的问题：能否设计一种蛋白质，让同一条氨基酸序列能够形成两种明显不同的三维结构？在此基础上，能否只改变两三个氨基酸，就让蛋白质主要形成其中一种结构？
为什么要设计能够改变折叠方式的蛋白质
蛋白质的功能与结构变化密切相关。识别分子时的局部调整、通道的开合、结构域之间的相对运动，都依赖蛋白质在不同构象之间转换。
对设计而言，两个结构分别能够稳定存在，只是起点。要让一条序列能够折叠为不同的两种构象，还需要协调两种状态的相对稳定性，以及连接它们的转换过程。
如果某一边过于稳定，蛋白质就会长期停留在一种构象下；如果两边都没有组织好，也可能出现局部无序。
作者据此把任务拆成三个环节：
先设计两个结构终点：保留核心，重塑末端
作者选择了 93 个长度不超过 150 个氨基酸的天然蛋白质结构域，保留它们的核心骨架，用 RFdiffusion 重新生成氨基端或羧基端的结构。
每个结构域的两个末端各生成 100 个候选构象，共计 200 个。被重塑的区域至少包含 20 个氨基酸，并覆盖至少一个二级结构单元，从而为较大幅度的结构变化留下空间。
tips：这里的重塑是，截掉末端的一段序列，然后让rfd重新生成相同长度的结构，这样一个骨架就有了两种不同的结构。
从天然骨架生成替代构象｜A 展示固定核心、重新生成末端的过程；B 根据结构偏差和二级结构变化筛选差异较大的构象。
经过筛选，58 个天然结构域贡献了 2,291 对目标构象。随后，作者用 ProteinMPNN 重新设计发生变化的末端及其接触残基，再用 AlphaFold2 检查序列能否折叠回目标结构。接近 30% 的替代态设计通过了结构一致性与预测置信度筛选。
作者最终选取三类体系开展实验：螺旋重新定向的 H2H、β 链转为螺旋的 B2H，以及螺旋转为 β 链的 H2B。它们分别来自人源 BAF 蛋白、Cas2 核酸内切酶和一种抗 σ 因子拮抗蛋白的结构。
三种结构变化与替代态验证｜F 展示螺旋重排、β 链转螺旋、螺旋转 β 链三对结构；G 将两种稳定替代态的设计模型与晶体结构叠合。
进入实验的 9 个替代态设计都表现出折叠的圆二色谱特征。其中，H2H 和 H2B 各有一个替代态获得晶体结构，实验结构与设计模型的全原子均方根偏差分别为 1.2 Å 和 1.6 Å。
这一步建立了可用于后续设计的结构终点：在保留部分核心骨架的前提下，同一类小型蛋白质可以容纳相当不同的末端结构。
两条序列设计路线：嵌合组合与交替优化
有了两个结构终点，下一步是寻找能够兼顾它们的序列。作者采用了两条互补路线。
在两条已有序列之间寻找组合
第一条路线从两个目标结构及其对应序列出发：一条序列能够稳定天然态，另一条能够稳定替代态。
作者首先固定两个结构共有的核心，用 RFdiffusion 调整发生变化的末端。在生成过程中，先通过引导势鼓励末端减少接触、部分松开，再引导其靠近另一种目标构象，从中获得一批中间骨架。
tips：在结构生成过程中加入两项额外的评分规则，先鼓励末端减少接触、松开原有结构，再引导它靠近另一种目标构象。
随后，作者用 ProteinMPNN 为每个中间骨架生成 5 条候选序列。设计时，每个位点只能选择天然态序列或替代态序列在对应位置的氨基酸。这样得到的新序列组合了两条端点序列的氨基酸，因此称为嵌合序列。
tips：也就是每个位置只有两个选择。
让两个骨架交替约束同一条序列
第二条路线开放全部氨基酸选择，只保留两个目标骨架。
作者先让 ProteinMPNN 针对一个构象计算氨基酸偏好，再将这些偏好作为下一轮设计另一个构象时的偏置。两个骨架反复交换信息，直到收敛到同一条序列。
两条路线得到的序列都经过 AlphaFold2 筛选。作者优先选择那些能够被预测为两个目标构象的候选，再进入实验。
结果一 蛋白质能否折叠与动态表现
作者在大肠杆菌中表达设计蛋白，并用体积排阻色谱结合多角度光散射、圆二色谱和核磁共振进行表征。
两类设计首先在热稳定性上表现出差异。
核磁共振进一步揭示了它们的差别。H2H 嵌合设计有较多谱峰展宽或缺失，难以归属的残基集中在预期发生结构变化的区域，与微秒至毫秒尺度的构象交换相符。
H2H 完全重新设计则获得了较清晰的谱峰，但深入的化学位移与动态分析发现，它的末端主要处于无序状态。
B2H 完全重新设计同样表现出明显的峰展宽、缺峰和强度不均，显示出丰富的动态行为。作者随后重点研究 H2H 嵌合设计和 B2H 完全重新设计，追踪这些动态对应怎样的结构变化。
结果二 分子动力学捕捉局部重折叠
作者分别从两种预测构象出发，进行了多条独立的分子动力学模拟。H2H 嵌合设计的累计采样时间达到 240 微秒，B2H 完全重新设计达到 179 微秒。
在 H2H 嵌合设计中，从天然样状态出发的 4 条轨迹里，有 3 条出现了氨基端螺旋重新定向，接近设计的替代构象，随后又重新访问天然样构象。过程中，末端螺旋经历了局部解折叠和重新折叠。
B2H 的表现有所不同。从天然样 β 片层状态出发的 6 条轨迹均较稳定；从替代螺旋态出发时，部分轨迹保持螺旋，另一些则出现解折叠、短暂恢复螺旋，以及局部 β 链形成。模拟过程中尚未到达完整的天然 β 片层构象。
两套体系由此呈现出不同的构象景观：
怎样把动态蛋白推向一个明确状态
动态也带来了实验上的难题：当多个构象持续交换时，核磁共振信号容易展宽，结构解析会变得困难。
作者因此转向一个可直接检验的问题：能否通过少量突变，稳定其中一个目标构象，让它变得更容易被实验捕捉？
对 H2H 嵌合设计，作者从两条端点序列中组合最多三处替换；对 B2H 完全重新设计，则先扫描变化区域及邻近位置的单点突变，再组合出偏向不同构象的双突变和三突变。
用少量突变调节构象偏好｜中间为原始多构象设计，两侧为指向不同状态的突变库；上方使用 AlphaFold3 筛选目标构象，下方通过 BioEmu 采样进一步评估构象分布。
候选首先经过 AlphaFold3 筛选，再交给 BioEmu 生成构象集合。作者从中挑选预测偏好明确的序列，进行表达和结构实验。
tips：BioEmu 根据序列等输入生成蛋白质构象集合，适合快速探索可能访问的结构。
结果三 三处突变，分别稳定 β 片层与 α 螺旋
B2H 体系给出了两种状态的实验结构。
其中，N54R、I58Y、K70Y 三处突变将设计推向天然样 β 片层构象；V34G、V50G、E69L 三处突变则稳定替代螺旋构象。两类变体的核磁共振谱均有所改善，出现更多可分辨的峰。
作者进一步解析了天然样变体的晶体结构，以及替代态变体的核磁共振结构。两者分别保留了预期的 β 片层和末端螺旋，与相应预测模型的骨架均方根偏差为 2.6 Å 和 2.2 Å。
两组突变稳定两种折叠方式｜A 为 BioEmu 构象采样；B 为对应的核磁共振谱。
突变如何起作用，可以从局部相互作用中找到线索。E69L 尤其直观：原来的谷氨酸在 β 片层态中参与静电相互作用，替换为亮氨酸后，这一联系被削弱；在螺旋态中，亮氨酸又改善了螺旋与核心之间的疏水堆积。
结果四 螺旋重排体系同样可以被突变调节
在 H2H 嵌合设计中，BioEmu 采样呈现出两个较明显的构象区域。引入状态稳定突变后，候选序列的预测分布向各自目标移动。
其中，K18L、A24P、G27I 三处突变稳定了替代构象。作者获得该变体的晶体结构，与预测模型的骨架均方根偏差为 1.8 Å，确认了设计的螺旋重排。
三处突变承担了不同作用。K18L 改善替代态的疏水核心，同时会在天然样态中暴露疏水侧链；A24P 位于替代构象的螺旋末端，却会扰动天然样构象中的螺旋；G27I 则进一步加强替代态的核心堆积。
指向天然样态的变体仍保留较强动态，核磁共振峰数没有明显增加。作者进一步比较谱图之间的相似性，发现这些变体彼此更接近，并与替代态变体形成区别。
总结
这项工作把多构象蛋白的设计连接成了一条完整流程：先通过末端重塑获得两个结构终点，再用嵌合组合或交替优化寻找共同序列，随后结合模拟与实验研究动态，最后通过少量突变稳定目标状态。
实验中，作者观察到了构象交换相关的核磁共振特征，并在模拟中捕捉到螺旋重排与局部重折叠。针对选中的设计，状态稳定突变进一步让不同目标构象进入可解析的范围，其中 B2H 的 β 片层态和螺旋态分别获得了晶体结构与核磁共振结构。
tips：构象交换这里突然想到之前发布的Dyna-1,用这个工具配合这个项目会不会更好一点
从蛋白设计角度看，最值得借鉴的是对两个状态同时进行考量：一个突变既可能改善目标态，也可能削弱竞争态。将两侧的作用放在一起，就有机会用很少的序列变化，显著改变整体折叠偏好。
tips：如果能把这种两构象转变变成可控的，比如让两种构象各占多少比例、多久切换一次，以及怎样接入配体或环境信号。这样的话感觉就可以衍生出很多有趣的内容。
参考论文
Khramushin A, Elia M, Schellhaas C, Borsatto A, et al. Computational design of protein conformational landscapes for metamorphic behavior. bioRxiv, 2026. DOI: 10.64898/2026.10.13.758820.