点击蓝字 关注我们
近些年来，宏基因组鸟枪测序（shotgun metagenomic sequencing）等高通量微生物组技术极大推动了宿主-肠道菌群互作研究。相比传统 16S rRNA 扩增子测序，宏基因组测序可在物种乃至菌株水平鉴定微生物，并同步注释功能基因，已成为肠道炎症研究的核心工具。
但在做菌群研究时都会遇到同一个瓶颈：临床队列与单纯组学测序大多只能建立菌群变化与疾病的相关性，很难回答关键因果问题 —— 菌群失调究竟是炎症发生的诱因，还是炎症损伤带来的继发性结果。近年高影响力期刊也反复强调：只有走“组学特征挖掘 + 体内外功能模型验证”的完整路线，才能支撑因果推断。
今天分享的这篇案例，正是遵循这一研究范式，将宏基因组鸟枪测序与两套结肠炎动物模型（DSS 化学损伤模型、CD4⁺CD62L⁺ T 细胞过继转移模型）结合，解析中药白头翁的活性成分白头翁皂苷 B4（Anemoside B4，AB4）干预溃疡性结肠炎（UC）的分子机制，区分其菌群依赖效应与直接免疫调控效应，为天然产物治疗炎症性肠病（IBD）提供一套可直接参考复用的研究思路。
基迪奥生物为本研究提供了宏基因组测序与分析服务。
研究背景：
溃疡性结肠炎（UC）具有反复发作、迁延难愈的特点，全球发病率持续走高。目前临床以糖皮质激素、JAK（Janus 激酶）抑制剂与生物制剂为主，虽有一定疗效，但存在长期副作用、完全缓解率仅 20%–30% 的短板，因此开发安全有效的新型候选药物具有重要现实意义。
肠道菌群与 CD4⁺ T 细胞构成的免疫轴是 UC 发病的核心环节，但菌群紊乱与免疫异常孰为因、孰为果尚未阐明，这也限制了中药天然产物向新药的转化。
该团队的前期工作已证实：口服 AB4 可剂量依赖性地缓解慢性复发性结肠炎，疗效与阳性药托法替尼（tofacitinib）相当；通过粪菌移植（FMT）实验，也初步提示其抗结肠炎作用至少部分经由肠道菌群介导，安全性已在犬体内得到验证。本研究正是针对这一空白，以“菌群清除 + 免疫过继转移”的双向设计，把相关性结论推进到因果层面。
研究结果 ：
完整肠道菌群是口服 AB4 缓解 DSS 急性结肠炎的必要条件
为检验肠道菌群对 AB4 体内药效的必要性，研究者先用广谱抗生素鸡尾酒（ABx：氨苄西林、新霉素、甲硝唑各 40 mg/kg，万古霉素 20 mg/kg）连续灌胃 7 天预处理 C57BL/6J 小鼠，构建菌群耗竭模型，再以 2% DSS（葡聚糖硫酸钠）诱导急性结肠炎，并给予 AB4（100 mg/kg，灌胃）干预。菌群耗竭效果以新鲜粪便活菌培养的菌落形成单位（CFU）计数予以验证。在肠道菌群完整的小鼠中，口服 AB4 可显著改善 DSS 引起的体重下降、疾病活动指数（DAI）升高、结肠缩短与结肠重量/长度比升高、脾脏指数升高，并减轻结肠组织病理损伤、降低组织学评分；而菌群被耗竭后，AB4 的上述体内保护作用基本消失，各项病理表型未见明显改善。
值得注意的是，单纯清除肠道菌群本身即可降低 DSS 诱导的炎症应答、减轻疾病严重程度，但并不能完全阻止结肠炎发生。这提示肠道菌群是 DSS 化学损伤模型中疾病充分发展的重要驱动因素，也与菌群缺失导致黏膜免疫应答减弱的既有认识相符。
图1 | AB4 依赖肠道菌群减轻急性结肠炎的疾病严重程度
AB4 体内抗炎效应依赖肠道菌群，但保留不依赖菌群的体外免疫抑制活性
分子水平检测显示：菌群完整的小鼠给予 AB4 后，结肠组织 TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、IL-6（白细胞介素-6）、IL-17（白细胞介素-17）、IFN-γ（干扰素-γ）mRNA 表达显著下调，血浆中 TNF-α、IL-6 蛋白水平同步下降。而在菌群耗竭的小鼠体内，口服 AB4 未能逆转 DSS 引起的促炎因子上调。
为区分 AB4 是“经菌群间接起效”还是“直接作用于免疫细胞”，研究设计了体内-离体联合的淋巴细胞再刺激实验：取自菌群耗竭小鼠、且体内接受过 AB4 灌胃的淋巴细胞，在 PMA/IM（佛波酯/离子霉素）再刺激后，TNF-α 分泌未被抑制；但若在体外培养体系中直接加入 1 μmol/L AB4 预处理 24 h，即使细胞来自菌群耗竭小鼠，TNF-α 释放仍被显著抑制。
这提示 AB4 分子本身具备不依赖菌群的直接免疫抑制活性，但不足以支撑口服后的整体疗效；三轮 2% DSS 慢性复发性结肠炎模型的重复验证结论一致，体外给药仍可抑制淋巴细胞 TNF-α 释放。
这组对照是全文的关键质控：体外抗炎结果不能直接解释口服疗效，天然产物研究须把“菌群依赖”与“直接作用”两条路径分开验证。
图2 | 肠道菌群介导 AB4 在急性结肠炎中的抗炎作用
AB4 能够缓解 CD4⁺T 细胞驱动的免疫介导型结肠炎
DSS 造模会直接造成肠上皮化学损伤，对菌群与免疫构成混杂干扰。为剥离这一因素、单独考察适应性免疫紊乱驱动的结肠炎，研究者将磁性负选纯化的初始 CD4⁺CD62L⁺ T 细胞（纯度经流式验证达 98.3%，图 5B）腹腔注射至 Rag1⁻/⁻ 小鼠（重组激活基因 1 敲除，缺失成熟 B、T 淋巴细胞），构建无化学损伤的免疫源性结肠炎模型，并于第 7 天起给予 AB4（100 mg/kg）干预 28 天。
过继转移后，受体小鼠出现典型 UC 病理改变：体重下降、DAI 升高、结肠缩短、结肠重量/长度比与脾脏指数升高、固有层炎症细胞浸润。AB4 干预自第 11 天起轻度改善体重丢失，但未达统计学意义；自第 24 天起 DAI 显著下降，结肠缩短、结肠肿胀与脾脏肿大均显著改善（P < 0.001），组织学损伤亦随之减轻。
机制层面，AB4 使结肠组织 TNF-α、IL-17 mRNA 与血浆 TNF-α、IL-17 蛋白水平基本回落至接近对照水平；同时上调紧密连接蛋白 ZO-1（闭锁小带蛋白 1）、Occludin（闭合蛋白）表达，抑制 S1PR1（1-磷酸鞘氨醇受体 1，调控 T 细胞迁移）与 p-STAT3（磷酸化信号转导与转录激活因子 3，调控 Th17 分化）的活化；免疫组化进一步证实，AB4 降低了结肠黏膜中 CD4⁺ T 细胞的定植。
图3 | AB4 改善 CD4⁺CD62L⁺ T 细胞过继转移诱导的免疫介导型结肠炎
AB4 直接抑制 CD4⁺T 细胞增殖、迁移以及 Th17 细胞分化
基于动物实验中观察到 AB4 抑制结肠 CD4⁺ T 细胞浸润这一现象，团队进一步用原代 CD4⁺ T 细胞开展体外功能实验，考察药物的直接作用。CCK-8 结果显示，0.1、1、10 μmol/L AB4 对 CD4⁺ T 细胞活力均无显著影响；在此基础上，10 μmol/L AB4 仍显著抑制 CD3/CD28 共刺激活化的 T 细胞增殖，说明其抗增殖作用与细胞毒性无关。Transwell 迁移实验显示，IL-6（50 ng/mL）可显著促进 CD4⁺ T 细胞跨膜迁移，而 AB4 以浓度依赖方式抑制该效应。
在 Th17 极化体系中，流式胞内染色显示极化后 CD4⁺IL-17A⁺ Th17 细胞比例显著升高，而 10 μmol/L AB4 处理可使其显著回落。可见 AB4 对 CD4⁺ T 细胞的增殖、迁移与致病性 Th17 分化均有直接抑制作用。
图4｜ AB4 体外抑制 CD4⁺ T 细胞的增殖、迁移与 Th17 分化
CD4⁺T 细胞扰动可重塑肠道菌群，AB4 可逆转免疫紊乱驱动的菌群失调
这是本研究的一大创新点。作者利用无 DSS 化学损伤的 T 细胞过继转移模型，结合宏基因组鸟枪测序（样本为 Rag1⁻/⁻ 小鼠结肠内容物，设 Sham、Transfer、Transfer+AB4 三组，每组 n = 4），回答一个关键问题：单纯的适应性免疫紊乱，是否足以改变肠道菌群？
Alpha 多样性（属水平）结果显示：过继转移诱导结肠炎后，模型组 Chao1 与 Shannon 指数显著下降，ACE 与 Simpson 指数无显著变化；AB4 干预可使 Chao1 显著回升。基于 Bray-Curtis 距离的 PCoA 分析显示，模型组群落组成与对照组明显分离，AB4 组与模型组之间亦存在显著差异。
物种组成方面，门水平上，模型组疣微菌门（Verrucomicrobiota）、拟杆菌门（Bacteroidota）相对丰度下降，厚壁菌门（Bacillota，旧称 Firmicutes）、假单胞菌门（Pseudomonadota）、弯曲杆菌门（Campylobacterota）相对丰度升高，AB4 可逆转上述改变（图 9A、9B）。属水平上，模型组阿克曼菌属（Akkermansia）相对丰度降低，拟杆菌属（Bacteroides）、螺杆菌属（Helicobacter）、乳杆菌属（Lactobacillus）相对丰度升高，AB4 同样可将其逆转。物种水平上，模型组嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）相对丰度显著降低、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）相对丰度升高，RT-qPCR 进一步验证了 A. muciniphila 的下降及 AB4 的回调作用。
这组数据提示：宿主 CD4⁺ T 细胞的免疫状态本身即可反向塑造肠道菌群，免疫紊乱足以诱发菌群失调；而 AB4 干预能够纠正这一由免疫异常驱动的微生态失衡。
图5 ｜ AB4 逆转免疫介导结肠炎引起的肠道菌群组成改变
小结：
本研究揭示了白头翁皂苷 B4 改善溃疡性结肠炎的双重作用模式：一方面直接靶向 CD4⁺ T 细胞，抑制其增殖、迁移与致病性 Th17 分化，阻断 STAT3/S1PR1 相关信号；另一方面，口服疗效离不开完整肠道菌群，药物可修复免疫紊乱诱发的微生态失衡、回升嗜黏蛋白阿克曼菌等有益共生菌。两条通路协同，构成其抗结肠炎的作用基础。
放眼炎症性肠病研究的未来，单一宏基因组测序已难以满足深度机制挖掘的需求，宏基因组 + 宏代谢组 + 宿主多组学整合分析正在成为主流。研究关注点也不再只是“肠道里有哪些微生物”，而是进一步回答“微生物产生了哪些代谢物、这些代谢物如何调控宿主黏膜免疫屏障”，推动菌群研究从群落描述走向分子因果机制。
在宿主-肠道菌群互作研究方向，基迪奥生物可提供从样本前处理、宏基因组/宏转录组测序、多组学联合高级分析到定制化图表输出的一站式服务；依托自研高性能计算集群与 Omicsmart 交互式分析平台，支持菌株水平精细解析、KEGG/CAZy/CARD 等多数据库功能注释与宿主-微生物关联统计分析，助力合作团队把微生物组研究从群落统计推向因果机制，产出高水平科研成果。
长按识别二维码咨询：
咨询当地销售或拨打客服电话：
*未经许可，不得以任何方式复制或抄袭本篇文章之部分或全部内容。版权所有，侵权必究。
分享科研绘图技能与工具
欢迎关注与转发~
你的好友拍了拍你
并请你帮她点一下“分享”~