04从原始Cq值到相对表达量

01对照组有20个样本，实验组有30个样本，到底应该拿谁跟谁比较？

上午九点，你打开电脑，准备分析昨天完成的qPCR实验。

对照组有20个独立生物学样本，实验组有30个。

每个样本都检测了IL6和一个参考基因，每种检测还设置了三个技术重复。

仪器导出了300个反应孔的Cq值，

你看着这一大串数字，开始犯愁。

如果只有一个对照样本、一个实验样本，事情好像很好办。

分别计算两个样本的ΔCq，再求ΔΔCq，最后代入：

2 − ΔΔCq

可现在对照组有20个样本。

到底选哪个作为对照？ 

是不是实验组第一个样本要分别和20个对照样本计算20次，第二个实验样本也算20次？ 

照这样下去，30个实验样本就需要完成600次比较。

再假设有五个实验组，每组50个样本，岂不是更麻烦？

这50份生物学样本，每一份都有自己的目标基因Cq值和参考基因Cq值。

我们希望了解的是，每一份样本中，目标基因相对于合适的参考基因处于什么表达水平。

等到每个样本都获得可比较的表达指标以后，再研究不同实验组之间的差异。 也就是说，计算需要沿着两个层次进行。

这就是为什么我们要连续进行归一化和组间比较，但今天还需要把经典计算方法与现代定量规范区分清楚。

2001年，Livak和Schmittgen系统介绍了经典的 2 − ΔΔCq 相对定量方法，

它在适当的扩增效率假设下非常方便，也能够帮助我们理解Cq差值与表达倍数之间的关系。

2025年发布的MIQE 2.0指南则进一步建议，在正式定量分析中优先使用经过扩增效率校正的目标核酸数量，逐样本进行归一化，再比较不同组的归一化表达量。指南明确提醒研究人员注意传统ΔΔCq方法的局限。

所以，这一章我们会先把经典公式彻底推导清楚，再使用同一套数据介绍更完整的定量方法。

02为什么不能直接拿两个样本的目标基因Cq相减？

1两份样本的IL6 Cq不同，可能只是因为加入的cDNA数量不同

你有两份细胞样本，A样本来自对照组，B样本来自药物处理组。

检测结果显示，A样本的IL6 Cq为25，B样本为24。

在理想的100%扩增效率条件下，B样本比A样本提前一个循环达到相同的荧光阈值。

这可能意味着B反应孔里加入的可扩增IL6目标模板数量约为A的两倍。

可是，两份反应最初加入的cDNA数量相同吗？

假设A样本加入相当于10 ng原始RNA的逆转录产物，B样本加入相当于20 ng原始RNA的逆转录产物。

如果其他条件完全一致，那么B样本可能仅仅因为投入的模板更多，导致IL6的Cq提前。

你如果直接计算：

225 − 24 = 2

就会得到B样本IL6为A样本两倍的结果，但这个两倍可能来自模板投入量，而非药物引起的相对基因表达变化。

研究人员因此需要一种方法，帮助减少样本投入量差异的影响，

这就是内参归一化的出发点。

2为什么要用同一个样本的目标基因减去内参基因？

我们现在增加一个经过稳定性验证的参考基因，得到以下数据。

你会发现，B样本的IL6 Cq提前了一个循环。

与此同时，参考基因也提前了一个循环。

如果参考基因在当前实验条件下保持稳定，那么这种共同变化可能与cDNA投入量等技术因素有关。

现在，我们分别计算每个样本内部的Cq差值。

公式为：

A样本：

ΔCqA = 25 − 20 = 5

B样本：

ΔCqB = 24 − 19 = 5

两个样本的ΔCq完全相同，虽然它们的IL6原始Cq不同，但目标基因相对于参考基因的Cq关系没有改变。 

在经典模型的扩增效率条件满足、参考基因稳定等前提下，这意味着两份样本的目标基因相对表达水平相同。 

现在，你应该能理解为什么要计算ΔCq了。

它把同一份生物学样本中的目标基因检测结果，与参考基因检测结果联系起来，

这样可以减少部分共同技术因素造成的差异。 

3ΔCq究竟有什么数学含义？

我们再往深处看一点，

第二章已经讲过，在理想的100%扩增效率条件下，某一检测体系的起始目标数量与Cq满足：

Q0 = K × 2 − Cq

这里，K表示与该检测体系有效荧光阈值等因素有关的常数。

对于目标基因，可以写成：

Q目标 = K目标 × 2 − Cq目标

对于参考基因：

Q参考 = K参考 × 2 − Cq参考

现在，我们希望研究目标基因相对于参考基因的数量关系，

把两个表达式相除：

Q目标Q参考 = K目标K参考 × 2 − (Cq目标 − Cq参考)

你会发现，括号里面就是ΔCq。 因此：

Q目标Q参考 = K × 2 − ΔCq

其中，K代表目标基因与参考基因检测体系之间的常数比例。

到这里，ΔCq的意义就清楚了。

在经典理想扩增模型下，2 − ΔCq与目标基因相对于参考基因的起始数量比例成正比。

因为不同靶标的荧光检测阈值和信号转换关系可能不同，所以不能直接把2 − ΔCq 理解为已经准确测得的真实分子数比例。

但如果使用相同的目标基因和参考基因检测体系，在不同样本之间进行相对比较，并且这些检测常数保持稳定，那么相应的常数可以在后续比值中抵消。

这就为ΔΔCq方法提供了数学基础。

03ΔΔCq究竟在计算什么？为什么要再减一次？

1计算完ΔCq以后，我们还需要一个比较基准

你现在有一个对照样本和一个实验样本，两份样本已经完成目标基因和参考基因的检测。

对照样本的ΔCq为5，实验样本的ΔCq为3。

你现在知道，实验样本内部的目标基因与参考基因关系发生了变化。

但如果我们希望把这种变化表示成实验样本相对于对照样本的倍数，就需要再引入一次比较。

这个比较就是ΔΔCq，经典定义为：

对于当前例子：

ΔΔCq = 3 − 5 =  − 2

然后计算：

2 − ΔΔCq = 2 − ( − 2) = 22 = 4

得到的结果是4，也就是说，在经典方法的假设条件下，实验样本的IL6相对表达量是对照样本的4倍。

2为什么ΔΔCq等于负数，表达量反而增加？

这个地方很多初学者第一次学习时都会有点困惑，

刚刚算出的ΔΔCq是-2，按普通数字的直觉，负数似乎意味着减少。

可是，对于qPCR，负的ΔΔCq经过指数转换，反而对应相对表达量增加。

原因在于Cq与起始模板量之间具有反向关系，起始模板越多，达到阈值所需要的扩增循环数通常越少。

因此，目标基因相对于参考基因更加丰富时，ΔCq可能减小。

如果实验组的ΔCq比对照基准小2：

ΔΔCq =  − 2

那么：

2 − ΔΔCq = 4

如果实验组的ΔCq比对照基准大2：

ΔΔCq = 2

那么：

2 − 2 = 0.25

相对表达量就变为对照的0.25倍，这里的0.25倍表示相对表达量下降到原来的四分之一，也就是减少75%。 

所以，以对照基准为1时，大于1表示相对表达量增加，小于1表示相对表达量降低。

倍数变化必须始终对应明确的参照对象。

04对照组只有一个样本很容易计算，可对照组有20个样本怎么办？

现在，我们正式进入这个专题最核心的多样本问题，你完成了50份独立生物学样本的RT-qPCR检测。 

对照组20份，编号C01至C20；实验组30份，编号T01至T30。

每个样本都检测IL6和一个经过稳定性验证的参考基因，每种检测有三个技术重复，并且已经通过必要的质量检查。

接下来，我们先沿用经典ΔΔCq计算框架，看看应该怎样处理。

1每个生物学样本都应该保留自己的检测结果

先拿对照组第一个样本C01举例。 它的IL6三个技术重复Cq分别为：

24.10, 24.20, 24.30

参考基因三个技术重复Cq分别为：

19.90, 20.00, 20.10

为了演示经典计算，假设检测体系满足相应扩增效率条件，技术重复也都通过了质量检查，我们采用每种检测的Cq算术平均数作为该样本的代表性Cq。

IL6平均Cq为：

CqIL6 = 24.10 + 24.20 + 24.303 = 24.20

参考基因平均Cq为：

CqRef = 19.90 + 20.00 + 20.103 = 20.00

于是，C01样本的ΔCq为：

ΔCqC01 = 24.20 − 20.00 = 4.20

现在轮到C02，你需要使用C02自己的IL6和参考基因结果，计算C02的ΔCq。

接着计算C03、C04，一直到C20。

实验组T01到T30也按照同样的原则处理。

220个对照样本，每个样本都会得到一个ΔCq

现在你的20个对照样本已经计算完成，为了方便学习，我们构造一组示例数据。

这是20份独立生物学样本的ΔCq。

虽然都属于对照组，但每个样本的数值略有不同。这很正常，因为不同生物学样本本来就可能存在基因表达差异，也会存在一定的测量变异。

现在我们希望选择一个统一基准，让实验组样本能够与整个对照组比较。

在经典ΔΔCq框架下，常见的一种方法是使用对照组20个ΔCq的算术平均数作为校准基准。 对于这套示例数据：

ΔCqControl = 20∑i = 1ΔCqCi20

计算得到：

接下来，这个5.00就成为所有样本共享的经典ΔΔCq校准值。

注意，我们求平均的是20份生物学样本各自的ΔCq，每个样本原本的数值仍然保留。

3为什么可以用对照组平均ΔCq作为统一校准值？

如果你只选C01作为基准，C01的ΔCq为4.20，那么所有样本的相对表达倍数都会以C01为1来计算，但C01只是20个对照生物学样本中的一个，它的表达水平可能高于或低于对照组的典型水平。 

如果研究目的关注实验组相对于整个对照组的变化，使用对照组的集中趋势作为统一校准基准，通常更符合比较目的。 

在经典ΔΔCq方法中，使用对照组平均ΔCq，等价于使用该组对应归一化表达指标的几何平均数作为参照，这也解释了为什么这种方法会自然地与对数尺度联系起来。

不过，校准基准的选择必须根据实验设计决定。

如果你研究的是某一位患者治疗前后的变化，并且每位患者都有真实配对样本，那么使用患者自身的治疗前样本建立配对参照，也可能更适合研究目的。

如果你比较多个独立处理组与同一个共同对照组，则通常可以让所有处理组使用一致的校准基准。

05实验组有30个样本，每个样本应该怎样计算ΔΔCq？

现在，你已经有了对照组统一校准值：

ΔCqControl = 5.00

接下来拿实验组第一个样本T01举例。 假设T01的IL6技术重复为：

22.00, 22.10, 22.20

参考基因技术重复为：

19.80, 19.90, 20.00

经过质量检查并按本例的经典方法汇总以后：

CqIL6 = 22.10
CqRef = 19.90

所以：

ΔCqT01 = 22.10 − 19.90 = 2.20

现在用T01的ΔCq减去对照组平均ΔCq：

ΔΔCqT01 = 2.20 − 5.00 =  − 2.80

代入经典相对表达公式：

FCT01 = 2 − ( − 2.80)
FCT01 = 22.80 ≈ 6.96

这意味着，在经典模型的假设条件下，T01的IL6相对表达水平约为对照组几何平均参照水平的6.96倍。

接下来计算T02，假设T02的ΔCq为2.30。

ΔΔCqT02 = 2.30 − 5.00 =  − 2.70
FCT02 = 22.70 ≈ 6.50

轮到T03，如果ΔCq为2.40：

FCT03 = 25.00 − 2.40 ≈ 6.06

你会发现，每个实验样本都保留自己的ΔCq，但它们使用同一个对照组校准值。

对照组的20份样本已经共同提供了参照信息，因此不需要再逐个与每份实验样本进行两两组合计算。

06一次算完50份样本：完整的多样本计算示例

下面这张表是本章专门设计的教学模拟数据，它包含20个对照样本和30个实验样本，每一行代表一份独立生物学样本。

为了让整张表能够阅读，IL6 Cq与参考基因Cq已经是通过质量检查后，按本章经典方法整理得到的代表性数值，原始技术重复需要另外保存在完整的反应孔数据表中。

表中的最后一列采用对照组平均ΔCq为5.00的经典校准方式计算。

继续看实验组。

现在看这张表，你应该已经能够自己检查任何一个样本的计算结果了。

比如T30，它的IL6 Cq为23.80，参考基因Cq为20.00。 所以：

ΔCqT30 = 23.80 − 20.00 = 3.80

对照组平均ΔCq为5.00。 所以：

ΔΔCqT30 = 3.80 − 5.00 =  − 1.20
FCT30 = 21.20 ≈ 2.30

和表中最后一行一致。

到这里，经典计算方法已经能够从一个样本扩展到50个样本。

如果增加到500个样本，计算原则仍然一样。

真正需要进一步考虑的，是如何合理汇总各组结果，以及怎样处理扩增效率、技术重复和生物学变异。

07为什么对照组明明设成了1，每个对照样本却不等于1？

这部分特别容易让初学者困惑，你可能已经注意到了，前面表格中，对照组C01的Fold为1.74，C20的Fold却只有0.57，可我们不是把对照组设成1了吗？

怎么对照组自己还有1.74和0.57？ 

这里要分清两个概念。 

一个是校准基准，另一个是各个样本相对于基准的表达倍数。

1把对照组设为1，究竟意味着什么？

在前面的计算中，我们使用的是对照组20个ΔCq的平均数：

ΔCqControl = 5.00

把这个平均ΔCq代入经典公式：

2 − (5.00 − 5.00) = 1

于是，对照组的几何平均表达参照被定义为1，但20个对照样本本来就存在差异。C01的ΔCq为4.20，所以：

FCC01 = 2 − (4.20 − 5.00)
FCC01 ≈ 1.74

C20的ΔCq为5.80，所以：

FCC20 = 2 − (5.80 − 5.00)
FCC20 ≈ 0.57

这些数字反映了各个对照样本相对于对照组共同校准基准的差异。

因此，对照组的样本点可以围绕1上下分布。

这恰恰保留了对照组内部的生物学变异信息。

2为什么对照组20个Fold的算术平均数可能不是1？

我们直接计算前面20个对照样本的Fold算术平均数。用未四舍五入的结果计算：

FCControl ≈ 1.041

咦？明明使用对照组平均ΔCq作为校准值，为什么算术平均数变成1.041？ 

原因在于指数转换，先对20个ΔCq求平均，再计算指数，与先分别计算20个指数，再求算术平均，通常会得到不同结果。

也就是说：

2 − ΔCq

与：

2 − ΔCq

通常并不相等。 在经典ΔΔCq计算中，使用平均ΔCq作为校准基准，意味着控制的是对照组倍数变化值的几何平均数。 因此，对于这套数据：

这里的GM表示几何平均数，而算术平均数约为1.041，这是指数转换与平均方式共同造成的数学结果。 如果你用Excel或者统计软件，把对照组20个Fold全部求算术平均，得到1.041，并不意味着公式算错了。

你需要先确认自己使用了哪一种校准和汇总方式。

3为什么有些论文里的对照组柱子又恰好等于1？

你可能在大量论文中看到，对照组是一根高度恰好为1的柱子，实验组则是2、3或4。

这类图可能采用了不同的数据处理方法，有些研究使用组平均ΔCq直接计算组间相对倍数。此时，对照组相对于自身的组级倍数自然等于1。

有些研究则先计算每个样本的归一化表达量，再以对照组归一化表达量的算术平均数作为分母。这样得到的对照组相对值，其算术平均数也会恰好为1。

还有些图只展示经过汇总后的组级估计，没有把各个对照样本的独立结果画出来。 所以，当你看到一篇论文把对照组画成1时，需要检查作者究竟采用了什么归一化和汇总方法。

08为什么“先算每个样本”和“先算整组平均值”，有时结果看起来一样？

有同学会发现一个数学现象，假设对照组每份样本都有完整的目标基因和参考基因数据。 你先分别计算：

ΔCqi = Cq目标,i − Cq参考,i

再求平均：

ΔCq

由于算术平均数具有线性性质：

ΔCq = Cq目标 − Cq参考

也就是说，如果两种检测对应的是完全相同的一组样本、没有缺失值，并且使用相同权重，那么先计算每个样本ΔCq再求平均，与先分别计算两个基因的组平均Cq再相减，得到的组平均ΔCq在数学上是相同的。

那么，为什么我们仍然强调每个样本应该单独计算？ 

因为最终研究需要保留生物学样本之间的差异。

假设你只保留一个组平均ΔCq，其他样本数据全部丢掉。

那么你已经无法知道20份对照样本是全部非常接近5.00，还是有人为2.00、有人为8.00，最后恰好平均为5.00。

这两种情况的组平均数相同，但组内变异完全不同。

统计分析需要这些变异信息，而且，如果目标基因与参考基因检测存在不同的缺失样本，或者采用不同权重，上述简单的平均数等式也能不再适用。

这也是处理多组多样本qPCR数据时非常重要的习惯。

09实验组整体究竟增加多少倍？为什么会出现4.00倍、4.17倍和4.01倍？

现在来看这套50个样本的数据，前面已经算出：

ΔCqControl = 5.00
ΔCqTreatment = 3.00

如果采用经典组平均ΔΔCq方法：

ΔΔCq = 3.00 − 5.00 =  − 2.00

那么：

FC = 2 − ( − 2.00) = 4.00

你会得到实验组相对于对照组增加4.00倍的结果，但如果你把30个实验样本各自的Fold全部求算术平均，会得到：

FCTreatment ≈ 4.172

为什么变成了4.172？ 

因为经典组平均ΔCq计算的4.00，代表的是实验组与对照组在相应几何平均表达尺度上的倍数关系。

而4.172是30个实验样本相对于对照组几何平均基准的Fold算术平均数。 

两种计算关注的汇总量不同。

更重要的是，2025年MIQE 2.0建议采用经过扩增效率校正的目标数量进行逐样本归一化，再根据组内归一化表达量计算组间倍数。

我们先用理想100%扩增效率的简化模型，演示这个思路。

1先得到每个样本的归一化表达指标

对于单个目标基因和参考基因，我们暂时使用一个与归一化表达量成正比的简化指标：

Ri = 2 − ΔCqi

这个指标省略了检测体系之间的常数，适合在当前理想模型中演示相同检测体系下的相对比较。

按照前面的50份模拟数据计算，对照组20个样本的平均R约为：

RControl = 0.0325383

实验组30个样本的平均R约为：

RTreatment = 0.1303639

现在把两组平均归一化表达指标相除：

FC组间 = RTreatmentRControl
 = 0.13036390.0325383

得到：

结果约为4.01倍。 你看，同一套数据，现在出现了三个数。

这些数字分别对应不同的汇总方式。

它们在这套模拟数据里很接近，是因为我们专门设置了较为规则的组内分布。 如果组内表达差异很大，甚至存在少数表达极高的生物学样本，这些结果之间的差异能进一步扩大。

2怎样让对照组归一化表达量的算术平均恰好等于1？

如果你选择按对照组的归一化表达量算术平均进行缩放，可以定义：

Ri* = RiRControl

这里，Ri代表每个样本的归一化表达指标。

那么，对照组20个样本的缩放值，其算术平均数就等于1。

实验组30个样本缩放后的算术平均数则约为4.006。

各个对照样本仍然保留自己的不同数值，改变的是整体缩放基准。

这种方法也便于把各组平均表达量放在一个相对于对照组为1的尺度上展示。

下面我们继续把这一问题补充完整。

10如果目标基因与参考基因的扩增效率不同，应该怎么算？

1为什么不能永远使用数字2？

第二章已经讲过，PCR理想扩增时每轮翻倍。

但真实的扩增效率可能为90%、95%或其他经过测定的数值。

假设IL6的扩增效率为90%，这意味着在采用相应简化模型时，每轮扩增倍数为：

A目标 = 1.90

参考基因的扩增效率为100%，其每轮扩增倍数为：

A参考 = 2.00

如果仍然假设两种检测都每轮翻倍，就能引入定量偏差。

2001年，Pfaffl提出了考虑目标基因和参考基因扩增效率的相对定量模型。 对于一个目标基因、一个参考基因以及明确的对照校准样本，可以写成：

R = A目标Cq目标,对照 − Cq目标,实验A参考Cq参考,对照 − Cq参考,实验

这里的A表示每轮扩增倍数。

2用一个例子看看效率校正的影响

假设： 

对照样本的IL6 Cq为25，参考基因Cq为20。

实验样本的IL6 Cq为23，参考基因Cq为19。 

如果直接使用经典ΔΔCq：

ΔCqControl = 25 − 20 = 5
ΔCqTreatment = 23 − 19 = 4
ΔΔCq = 4 − 5 =  − 1

因此：

FC = 21 = 2

得到2倍。 

现在假设IL6每轮扩增倍数为1.90，参考基因为2.00。使用效率校正模型：

R = 1.9025 − 232.0020 − 19
R = 1.9022.00
R = 3.612

结果变成约1.81倍。

这个例子说明，在不同扩增效率条件下，经典公式与效率校正模型能得到不同结果。

当基因表达差异很小、扩增效率差异较大，或者研究需要精确报告表达倍数时，这种影响尤其需要考虑。

不过，Pfaffl模型也需要满足相应的效率估计和检测条件假设。

对于包含大量样本、多个参考基因以及反应孔间扩增性能差异的实验，利用经过验证的逐反应定量方法计算目标数量，通常能更完整地利用原始检测信息。

11如果每个样本检测两个或三个内参，应该怎么办？

前面一直假设每个样本只有一个参考基因，可第三章已经讲过，单个参考基因能受到实验条件影响。 

因此，研究人员有时会选择两个或三个经过稳定性验证的参考基因共同进行归一化。 

假设你的实验检测IL6，同时检测HPRT1和RPLP0两个参考基因。

现在，你的每份生物学样本都有三套检测数据。 

目标基因IL6的Cq，参考基因HPRT1的Cq，参考基因RPLP0的Cq。

那么该怎样计算？

1经典理想扩增模型中的简化计算

假设三个检测体系的扩增效率都近似为100%，并符合经典模型的其他要求。

你可以先计算两个参考基因的平均Cq：

CqRef,mean = CqHPRT1 + CqRPLP02

再计算：

ΔCq = CqIL6 − CqRef,mean

例如，某个样本：

CqIL6 = 25
CqHPRT1 = 20
CqRPLP0 = 22

两个参考基因的平均Cq为：

20 + 222 = 21

因此：

ΔCq = 25 − 21 = 4

在相同扩增倍数和相应常数条件下，两个参考基因Cq的平均，对应它们数量尺度的几何平均关系。

这就是为什么在经典方法中，会出现对多个参考基因Cq取平均的做法。

2更完整的方法：先计算各参考基因数量，再取几何平均

假设我们已经使用合适的定量方法，得到每个参考基因经过效率校正的数量估计。

记为：

QRef1, QRef2

那么两个参考基因的几何平均归一化因子可以写成：

NF = √QRef1QRef2

如果有三个参考基因：

NF = (QRef1QRef2QRef3)1/3

然后使用：

Ri = Q目标,iNFi

得到每个生物学样本的归一化表达量。

这样可以保留每个参考基因自己的定量信息，并根据相应的扩增效率进行校正。

实际使用时，多个参考基因的稳定性需要经过验证，各检测数量也要按一致且有依据的方法校准或缩放。

2002年Vandesompele等人提出的多参考基因几何平均归一化方法，为这一思路提供了经典研究基础。

12如果对照组和实验组有配对关系，计算方式有什么变化？

现在，我们把实验换成另一种情况。

假设你有20位患者，每位患者在治疗前采集一次样本，治疗后再采集一次，共得到40份生物学样本。

但是，这40份样本来自20位患者，每位患者的治疗前后样本存在配对关系。

假设P01患者治疗前的ΔCq为5.0，治疗后的ΔCq为3.0。 

在经典模型条件下，患者自身的变化可以计算为：

ΔΔCqP01 = 3.0 − 5.0 =  − 2.0

得到：

FCP01 = 22 = 4

对于P02患者，也应该保留自己的治疗前和治疗后数据。

如果采用以患者自身为参照的经典计算方法，就可以为每位患者计算对应的治疗前后变化。

如果采用效率校正的数量方法，则可以先为每个时间点计算归一化表达量，再用保留患者配对关系的模型分析治疗变化。

因此，多样本分析之前，必须先判断实验是独立样本设计还是配对设计，计算和统计应当遵循真实的实验结构。

13如果实验有五个组，每组几十个样本，应该怎么分析？

假设你的研究包含五组。

• 正常对照组
• 疾病模型组
• 药物低剂量组
• 药物中剂量组
• 药物高剂量组

每组都有20个独立生物学样本，现在一共有100个样本，每个样本都检测IL6和经过验证的参考基因。 

对于经典ΔΔCq方法，你可以先为100个样本分别计算ΔCq。

然后根据研究目的，选择一个共同的校准基准。

假设你希望比较各组相对于疾病模型组的表达变化，那么可以使用疾病模型组的平均ΔCq作为统一参照。

如果你希望比较各组相对于正常对照组的变化，则可以使用正常对照组作为参照。

对于不同的研究问题，选择的参照可以不同。

但同一组比较必须明确使用了什么基准，

例如，如果统一参照组的平均ΔCq为5.00，假设某个处理组的平均ΔCq为4.00。

在经典模型下，它相对于参照组几何平均水平的倍数为：

2 − (4.00 − 5.00) = 2

另一个处理组平均ΔCq为3.00：

2 − (3.00 − 5.00) = 4

再有一个处理组平均ΔCq为5.70：

2 − (5.70 − 5.00) ≈ 0.62

这几个结果都相对于同一个参照组。

研究人员需要提前确定哪些差异对应自己的研究假设。

例如，疾病模型组相对于正常对照组是否改变了IL6表达，以及各药物剂量组相对于疾病模型组是否出现变化。

这些属于统计分析设计的问题，第五章会专门讲解。

14用Excel计算50个样本，公式应该怎么写？

理解公式以后，实际操作就容易多了。

假设你已经完成原始技术重复质量检查，并得到每个生物学样本的目标基因和参考基因代表性Cq。

现在打开Excel，我们设计以下列结构：

假设第2行是C01，第51行是T30。

B列的分组名称统一使用Control和Treatment。

1计算每个样本的ΔCq

在E2输入：

=C2-D2

把公式向下填充到E51，这样，50份生物学样本都会得到自己的ΔCq。

2计算对照组的平均ΔCq

假设我们把对照组平均ΔCq放在J2，输入：

=AVERAGEIF($B$2:$B$51,"Control",$E$2:$E$51)

这个公式会从E列中找出B列标记为Control的样本，再计算这些样本ΔCq的平均值。

对于前面的教学模拟数据，结果为：

J2 = 5.00

3计算每个样本的ΔΔCq

在F2输入：

=E2-$J$2

再向下填充，这里的$J$2是绝对引用。

当你向下拖动公式时，对照校准值的位置保持不变。

所有样本都会使用相同的校准基准。

4计算经典相对表达倍数

在G2输入：

=POWER(2,-F2)

或者：

=2^(-F2)

再填充到G51。

这样，每个样本都会得到对应的经典相对表达倍数。

对于C01，结果约为1.74。

对于T01，结果约为6.96。

5使用归一化表达指标进行组平均比较

接下来，我们演示前面介绍的理想效率条件下的简化数量分析,在H2输入：

=POWER(2,-E2)

这个公式计算的是与样本归一化表达量成正比的简化指标,将它填充到H51,然后在K2计算对照组该指标的平均数：

=AVERAGEIF($B$2:$B$51,"Control",$H$2:$H$51)

对这套示例数据，K2约为：

0.0325383

现在在I2输入：

=H2/$K$2

向下填充以后，每个样本都被缩放到以对照组算术平均为1的尺度。

如果你想检查对照组的平均值，可以输入：

=AVERAGEIF($B$2:$B$51,"Control",$I$2:$I$51)

结果为1。 

再计算实验组：

=AVERAGEIF($B$2:$B$51,"Treatment",$I$2:$I$51)

得到约4.006。

•••

本章参考文献

Livak K. J., Schmittgen T. D. (2001). Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods, 25(4), 402–408.

Pfaffl M. W. (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 29(9), e45.

Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., et al. (2002). Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology, 3(7), research0034.

Bustin S. A., Ruijter J. M., van den Hoff M. J. B., et al. (2025). MIQE 2.0: Revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Guidelines. Clinical Chemistry, 71(6), 634–651.