抗体孵育、洗片、封片，全程小心翼翼，结果一上机——
目标明明在，但荧光若有若无，调曝光就一片白，不调曝光就什么都没有；
信号是有了，可边界像在水里化开的墨，分不清是细胞膜还是隔壁细胞漏过来的；
做多重染色，想做四个标志物同屏，第二轮染色一上，第一轮的颜色就开始"爬"到不该在的通道里。
问题往往不在抗体，也不在显微镜，而在信号没有被"钉"在原位。传统免疫荧光是 “一对一” 的信号模式：一个抗体仅携带有限数量荧光基团。当靶标蛋白表达量很低时，输出信号就捉襟见肘。一味提高抗体浓度，又会带来严重的非特异性结合，信噪比直接崩盘，很多实验就卡在这一步进退两难。而酪胺信号放大技术（TSA, Tyramide Signal Amplification），正是解决上述问题的常用策略之一，大幅提升检测灵敏度，让微弱靶标也能获得干净、定位精准的荧光成像。
于此， Lumiprobe提供覆盖绿光至近红外多个波段的酪胺偶联染料，为 TSA 信号放大开发，可用于单染及多色mIHC实验的染料选择。西宝生物是 Lumiprobe 授权代理，原装进口，可为TSA实验的建立与优化提供产品与技术支持，咨询热线：400-021-8158
TSA 酪胺信号放大技术的原理
TSA 技术核心依靠辣根过氧化物酶 HRP 的酶促催化反应：
1. 一抗识别靶抗原，结合 HRP 标记二抗；
2. 在低浓度过氧化氢存在条件下，HRP 将荧光标记酪胺底物，转化成高活性自由基中间体；
3. 活化后的酪胺自由基会快速与抗原周边蛋白的酪氨酸残基发生共价结合，在靶标位点附近大量沉积荧光染料分子，实现信号放大。
关键优势：
灵敏度提升：对比常规免疫荧光检测，在部分已发表的比较研究中，TSA可将免疫荧光检测的灵敏度较常规方法提高约10–100倍，非常适合低丰度靶点检测。即便不需要超高灵敏度的实验场景，也可以降低抗体使用浓度，减少非特异性结合，压低背景噪音。
共价结合，支持多轮多重染色：酪胺-染料复合物是共价锚定在组织蛋白上。使用酸性甘氨酸缓冲液处理，就可以洗脱一抗、二抗复合物，酪胺染料标记信号不受破坏。同一张切片可以进行多轮 TSA 循环染色，实现多重靶标检测，不受一抗宿主物种限制，这也是 mIHC 多重免疫荧光的核心基础。
应用场景广：适配免疫组化 IHC、细胞免疫荧光 ICC、荧光原位杂交 FISH 等多种实验体系，FFPE 石蜡切片、细胞爬片样本均适用。
TSA实验操作流程
以下流程来自 Lumiprobe 官方 TSA Protocol，适用于 HRP 标记体系（免疫染色或原位杂交），全程在摇床上孵育。
试剂准备
2–4% 多聚甲醛，pH 7.4
PBS，pH 7.4
PBT：0.1% Tween-20 + PBS，pH 7.4
1 mM 叠氮化钠（NaN3）的 PBT 溶液（抑制剂）
30% H2O2
1 mg/mL 荧光标记酪胺，溶于 Labeling Grade DMSO（标记级 DMSO）
可选：硫酸葡聚糖（DS）、4-碘苯酚、酸性甘氨酸缓冲液（0.1 M 甘氨酸 pH 2.0 + 0.1% Tween-20）
操作步骤
固定与洗涤：用冷的 2–4% 多聚甲醛（pH 7.4）固定样本，PBS 洗净固定剂，再用 PBT 洗涤。
封闭内源性过氧化物酶：在含 1 mM 叠氮化钠的 PBT 中，室温孵育 30–60 min。
替代方案：也可用 PBT 中 3% H2O2 或 0.02 N HCl 抑制；
做后续免疫化学时，可在这一步同时封闭抗体非特异性结合——在叠氮化钠或 H2O2 溶液中加入封闭血清或 1% BSA；
若本底很低、或做原位杂交，此步可跳过。
洗净抑制剂：PBT 室温孵洗 3 次 × 10 min。
完成上游标记：按常规免疫染色或原位杂交流程，用 HRP 标记抗体（或 HRP 标记的链霉亲和素）标记样本。
洗净抗体：PBT 室温孵洗 3 次 × 10 min。
临用前现配反应缓冲液：将 PBT 用含 30% H2O2 的溶液做两次 1:100 稀释（每次稀释 2 倍），使 H2O2 终浓度为 0.003%（1:10000）。
可选增效：向反应体系中加入 2% 硫酸葡聚糖以提高黏度，或加入 500 µg/mL 4-碘苯酚以增强过氧化物酶反应（可用 100 mg/mL 乙醇母液按 1:200 稀释加入，更方便）。两者可单用或合用。
加入荧光酪胺：工作液浓度为 1–10 µg/mL，适宜浓度需通过实验确定，加入后混匀。
避光显色：室温、避光孵育 5–30 min（建议从 15 min 起试，具体时长实验确定）。
终止反应：转入 1 mM 叠氮化钠的 PBT 溶液中，室温避光孵育 10 min。
洗涤：PBS 洗 3 次 × 10 min。
（多重染色才需要）酸洗脱：用酸性甘氨酸缓冲液（0.1 M 甘氨酸 pH 2.0 + 0.1% Tween-20）室温处理 10 min。这一步能把与抗原结合的抗体从样本上解离下来，但不影响已共价结合在蛋白上的酪胺——于是你可以继续下一轮"抗体→HRP→酪胺"循环。
封片：使用抗淬灭封片剂，加盖玻片。
注意要点
反应缓冲液必须临用前现配。
酪胺请用标记级（Labeling Grade）DMSO 溶解。
TSA实验常见翻车现场及应对措施
现象 |
建议处理 |
信号弱 |
优化探针/抗体浓度；对 HRP 标记物做滴度实验确定适宜浓度；增加组织通透步骤以利试剂渗透；延长酪胺工作液孵育时间；用抗原修复暴露被遮蔽的表位 |
信号过强 |
优化探针/抗体浓度；降低 HRP 标记物浓度；降低工作液中酪胺浓度；缩短酪胺孵育时间 |
分辨率低、信号发糊 |
缩短酪胺工作液孵育时间；检查终止试剂的稀释倍数是否正确 |
背景高 |
降低探针/一抗浓度；降低二抗浓度；降低 HRP 标记物浓度；核查内源性生物素（使用链霉亲和素复合物时）；核查抗体特异性；缩短酪胺孵育时间；延长内源性过氧化物酶封闭时间；增加洗涤次数或延长洗涤时间；确认封闭试剂合格、未被污染；对缓冲液进行过滤 |
背景上出现亮斑 |
二抗使用前先离心管底，聚集的蛋白是常见原因 |
产品列表
货号 |
产品 |
荧光/功能 |
常用场景 |
Ex/Em (nm) |
3805 |
AF 488 tyramide |
绿光 |
IHC / ICC / FISH 的 TSA 放大 |
495 / 519 |
3718 |
sulfo-Cyanine3 tyramide |
橙光 |
与绿光通道错开的多色组合 |
548 / 563 |
3804 |
AF 594 tyramide |
红光 |
避开绿-橙串色的多色组合 |
586 / 613 |
3796 |
sulfo-Cyanine5 tyramide |
远红光 |
深层组织、自发荧光高的样本 |
646 / 662 |
3858 |
sulfo-Cyanine5.5 tyramide |
远红光 |
与 Cy5 分档的多色组合 |
673 / 691 |
3836 |
sulfo-Cyanine7 tyramide |
近红外光 |
自发荧光干扰强、小动物活体相关检测 |
750 / 773 |
4903 |
Biotinyl tyramide |
生物素化酪胺，无荧光 |
沉积生物素后，用标记链霉亲和素复合物二次显色 |
— |
5401 |
Alkyne tyramide |
酪胺 + 炔基双功能分子 |
APEX2 邻近标记，后续点击化学连接荧光叠氮 |
— |
本产品仅供科学研究使用，不用于临床诊断、治疗或人体/动物活体应用。
关于Lumiprobe
Lumiprobe Corporation是美国一家高品质生物技术公司，专业提供分子生物学研究用的活性荧光染料。从2006年开始，公司生产并销售生命科学研究和诊断学应用的优质化学品。产品包括：酪胺染料、羧酸类染料、羰基类染料，标记分子氨基活性染料，标记分子巯基活性染料，动物活体成像用染料，蛋白质、多肽、核酸等生物分子标记染料、点击化学等。西宝生物作为其一级代理，渠道正规，质量保证，具体价格及优惠请咨询：400-021-8158。
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