突破大位阻合成瓶颈：协和药生所付海根课题组在轴手性氮杂䓬酶催化合成领域取得Angew新进展

图1 轴手性二苯[c,e]氮杂䓬的应用与合成策略。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

研究团队首先选取联芳基二醛rac-4a与苄胺5a作为模板底物，对覆盖不同来源的亚胺还原酶文库开展系统性筛选。其中，源自Streptomyces tricolor的IRED-04展现出独特的催化活性，可驱动目标串联还原胺化过程，以50%的产物收率和99:1的对映体比例得到轴手性构型确定的目标产物(R)-6。

随后团队对反应体系参数进行系统性优化，在酶负载量低至0.2 mol%的条件下，野生型IRED-04的催化反应收率可提升至57%，但整体催化效率仍未达到制备级应用的要求。为进一步突破活性瓶颈，研究团队解析了IRED-04与辅酶NADPH形成的蛋白-小分子复合物的高分辨率晶体结构，结合底物分子对接模拟锁定活性口袋中的关键突变位点，完成三轮基于结构理性引导的定向改造，最终获得三突变体IRED-04-M3（A129F/N239G/I217Q）。

在25 ℃反应条件下，该定向进化得到的突变体可将模型反应的产物收率提升至82%；进一步将反应温度调整至37 ℃后，反应的分析收率可进一步提升至94%，且全程维持99:1的高对映选择性。值得注意的是，直接使用IRED-04-M3的粗酶冻干粉进行催化，仍可实现96%的分离收率与99:1的优异er值，展现出该生物催化体系极强的操作兼容性与应用潜力。

图2 模型反应筛选与酶工程改造。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

图3. 底物范围拓展。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

研究团队结合中间体捕获实验、还原控制实验、密度泛函理论计算与分子动力学模拟，完成了该级联反应的过程解析与立体控制机制阐释。通过可富集环状亚胺鎓中间体的突变体A129F/L221F，搭配邻羟基苄胺作为捕获试剂，成功分离得到含N,O-缩醛结构的产物32，直接证实底物4a的2位醛基优先发生分子间还原胺化。

后续酶反应淬灭实验同步得到亚胺鎓中间体3a与产物(R)-6的混合物：以非选择性还原剂NaBH₄处理时，3a完全转化但产物er仅为57:43；以IRED-04-M3催化时，3a可完全转化且产物er达99:1，证明3a为消旋体，该步酶促还原通过动态动力学拆分实现轴手性控制。基于此提出完整催化机理：rac-4a与5a先经分子间还原胺化生成中间体33，再环化得到环状亚胺鎓rac-3a，二者通过可逆形成六元半缩醛34实现轴手性快速消旋；IRED-04-M3选择性识别并还原(R)-3a，经DKR过程最终生成构型稳定的(R)-6。分子动力学模拟显示，N239G突变可扩大酶结合口袋，使中间体苄基采取更适配的结合取向；与野生型相比，M3突变体中(R)-3a的亚胺鎓碳与辅酶烟酰胺环C4距离更短，计算结合能更优，从结构层面解释了突变体催化效率的提升机制。

图4. 机理研究与分子动力学模拟。图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.

总结，本研究通过结构指导的定向进化，获得了能够连续催化分子间和分子内还原胺化的工程化亚胺还原酶，并借助动态动力学拆分策略，首次实现了四邻位取代的轴手性二苯[c,e]氮杂䓬的不对称合成。该策略在构建七元含氮环的同时实现了轴手性控制，展示了生物催化在大位阻桥联联芳基合成中的应用潜力，也为相关轴手性含氮杂环的制备提供了新的酶催化方法。相关成果发表于Angew. Chem. Int. Ed.。协和药生所研究生周梓添、晏宇轩以及梵帅助理研究员为共同第一作者，协和药生所黄玲助理研究员、杨兆勇研究员、付海根研究员为共同通讯作者。

原文信息：

Zitian Zhou^#, Yuxuan Yan^#, Shuai Fan^#, Zhouchang Yao, Wenbang Wang, Keting Li, Tianzhang Qiao, Ling Huang*, Zhaoyong Yang*, Haigen Fu*. Atroposelective Construction of Tetra-ortho-substituted Dibenz[c,e]azepines Using an Engineered Imine Reductase. Angew. Chem. Int. Ed., 2026, DOI: 10.1002/anie.1024447.