2025 年 5 月 30 日，悉尼科技大学、华盛顿大学、伊利诺伊大学厄巴纳—香槟分校和浙江大学的研究者在 arXiv 发布论文 Improving Protein Sequence Design through Designability Preference Optimization，提出残基级可设计性偏好优化方法 ResiDPO，并用它微调 LigandMPNN，得到蛋白质序列设计模型 EnhancedMPNN。
在前几天介绍的 Baker 组的新发的 Nature 的文章中，看到作者用到了这个工具，今天查了一下也是 Baker 组做的，在这里就解读一下。
作者主要解决一个具体问题：给定一个设计好的蛋白质骨架，怎样让模型生成的序列更容易折叠成预期结构？
现有序列设计模型通常学习恢复天然蛋白质的原始序列。但在从头设计中，更直接的目标是找到能够形成目标结构的序列。作者把 AlphaFold2 的结构预测反馈加入训练，让模型学习哪些序列更符合这一目标，并把反馈细化到每一个残基位置。
论文得到几项主要结果。
tips：ResiDPO 是 Residue-level Designability Preference Optimization 的缩写，中文可译为“残基级可设计性偏好优化”。
核心方法 把整条序列的好坏，拆解到具体残基位置
常见的设计流程是先生成蛋白质骨架，再由序列设计模型为骨架分配氨基酸，最后用结构预测模型检查生成序列能否形成目标结构。大量候选会在最后一步被筛掉。
作者希望把这一轮筛选提供的信息提前用于训练。基本过程包含三步。
这种训练方式借鉴了直接偏好优化，也就是 DPO。它利用两个候选之间的优劣关系调整模型，不需要为每个骨架指定唯一的正确序列。
但整条序列的平均分会掩盖局部差异。一条序列总体得分更高，并不意味着它的每个位置都更好。如果把整条高分序列一起奖励，一些表现变差的位置也可能被一并强化。
ResiDPO 将训练拆成两部分。
第一部分是残基级偏好学习。 比较两条序列在对应位置的 pLDDT，只在优选序列局部评分高出超过 10 分的位置上，强化对优选残基的相对偏好。
第二部分是残基级约束学习。 对优选序列中 pLDDT 高于 80、且原模型赋予该氨基酸的概率高于 0.5 的位置，约束微调后的预测不要过度偏离原模型。
这样，局部改善明显的位置提供学习信号，已经可靠的位置帮助保留原有结构知识。两部分共同作用，形成 EnhancedMPNN 的训练目标。
tips：简单理解就是用将af2的模型学习到的一些结构规则通过这种方式传递到mpnn模型中，让mpnn生成的序列更符合af2的”口味“。
数据准备 用结构预测建立逐残基反馈数据集
作者从蛋白质结构数据库中筛选单体结构，要求来自分辨率优于 3.5 Å 的 X 射线晶体学测定，蛋白质长度小于一千个残基，构建名为 PDB-D 的数据集。
数据划分同时考虑发布时间和结构相似性。2021 年 9 月 30 日之后发布的结构被指定用于验证；经过结构聚类后，包含这些结构的簇也划入验证部分，其余簇用于训练。
最终得到 19,203 个训练结构和 1,690 个验证代表结构。作者对每个结构生成八条序列，采样温度设为 1.0，以增加序列多样性，再运行 AlphaFold2，获得逐残基评分。
配对时，作者比较了三种策略：选择最高分序列与其他序列配对；只选择高于 80 分与低于 75 分的序列配对；或者使用任意两条评分差超过阈值的序列。
第三种策略表现最好。它能够利用更多骨架上的相对改善，即使某个骨架暂时还没有产生高于 80 分的序列，也可以为训练提供有效样本。后续实验采用 10 分作为配对阈值。
结果一 酶设计通过率提高，更多骨架找到可用序列
作者使用五类酶的催化位点作为起点，通过 RFdiffusion2 为每类酶生成一千个骨架，再由各个序列设计模型为每个骨架生成八条序列。催化残基保持固定，序列采样温度设为 0.1。
这一测试关注结构匹配：AlphaFold2 预测的 pLDDT 高于 80，且预测结构与目标骨架的 Cα 均方根偏差小于 1.5 Å，即记为通过。
五类酶的设计结果。左侧统计通过筛选的序列比例；右侧统计每个骨架生成八条序列后，至少有一条通过的骨架比例。粉色、紫色和蓝色分别代表原始 LigandMPNN、普通 DPO 微调模型和 ResiDPO 微调模型。
EnhancedMPNN 的平均序列通过率达到 17.57%，原始 LigandMPNN 为 6.56%，五类酶上均有改善。
骨架层面的变化同样明显：至少获得一条通过序列的骨架比例，从 19.74% 提高到 40.34%。在相同的八次采样机会下，新模型让更多骨架找到了符合结构要求的序列。
这给设计流程带来一个直接启发：一个骨架暂时没有筛出合适序列时，改进序列设计模型本身，也可能提高这个骨架的利用率。
结果二 单体结构上学到的偏好，也能改善结合物设计
训练数据以单体蛋白质为主，作者进一步检验模型能否用于蛋白质结合物设计。
测试包含 PD-L1、白细胞介素 7 受体 α 亚基、胰岛素受体、TrkA 受体和流感血凝素五个靶标。每个靶标使用一百个生成骨架，每个骨架设计八条序列，并固定靶标链。
通过标准同时涉及结合物自身和复合物构象：pLDDT 高于 80，链间预测对齐误差小于 10，整体 Cα 均方根偏差小于 1 Å。
五个蛋白质靶标的结合物设计结果。左侧为序列通过率，右侧为骨架通过率。不同靶标的基础难度不同，ResiDPO 微调模型在五个靶标上均取得提升。
|
|
|
|---|---|
|
|
|
|
|
|
|
|
16.07% |
普通 DPO 已经带来改善，逐残基优化进一步扩大了收益。这说明在单体结构上学到的序列偏好，也能帮助模型生成更符合目标复合物构象的候选。
作者还展示了两个结构案例，分别对应酶的催化口袋和结合物与靶标的相对位置。
a、b：预测结构与设计骨架的叠合。a 为酶设计案例，蓝色的 ResiDPO 预测结构更贴近灰色目标骨架，催化口袋附近的构象也更吻合；b 为结合物案例，蓝色结构更好地保持了与橙色靶标的预期相对位置。粉色和紫色分别对应原始模型与普通 DPO 模型。
结果三 局部学习与知识保留共同起作用，小数据量下也有收益
作者用消融实验比较了普通 DPO、单独的残基级偏好学习，以及完整的 ResiDPO。
这里使用两个指标：天然序列恢复率，以及论文定义的 pLDDT 偏好准确率。后者用于评价模型是否更倾向于给高 pLDDT 的验证序列更高概率，便于在不反复运行结构预测的情况下比较训练方案。
|
|
|
|
|---|---|---|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
55.56% | 66.08% |
只加入局部偏好学习时，模型对高分序列的偏好增强，但天然序列恢复率下降较多。补上残基级约束后，恢复率回升，偏好准确率也进一步提高。保留可靠位置的原有知识，有助于局部学习取得更好的整体效果。
作者随后减少训练骨架数量，比较两种方法的数据利用效率。
不同训练骨架数量下的偏好准确率。横轴为抽取的训练骨架数，纵轴为 pLDDT 偏好准确率；蓝色为 ResiDPO，紫色为普通 DPO。
只使用一百个骨架时，普通 DPO 的表现有所下降，ResiDPO 已经能够获得改善。抽取一千个骨架时，ResiDPO 达到约 63.44% 的偏好准确率，与使用约一万九千个骨架的普通 DPO 处于相近水平。
在这一千个骨架中，实际只有 502 个满足评分差超过 10 分的配对条件。逐残基反馈让有限的训练样本提供了更具体的优化信息。
结果四 优化结构置信度后，氨基酸组成也随之改变
EnhancedMPNN 生成的序列发生了哪些变化？作者分别在天然骨架和新设计的酶骨架上比较了氨基酸组成。
整体上，微调后的模型增加了谷氨酸、赖氨酸和精氨酸等带电残基的使用，并减少了部分丙氨酸。在设计骨架上，丙氨酸减少、谷氨酸增加的趋势尤其明显。
不同模型生成序列的氨基酸组成。左侧为天然骨架，右侧为新设计的酶骨架。粉色、紫色和蓝色分别对应原始模型、普通 DPO 和 ResiDPO。横轴采用氨基酸单字母代码，其中 A 为丙氨酸，E 为谷氨酸，K 为赖氨酸，R 为精氨酸。
作者提出，这些变化可能减少了序列与结构对应关系中的模糊性。带电残基通常更适合暴露在溶剂中，而丙氨酸既可位于内部，也可出现在表面，对局部环境的指示相对不明确。甘氨酸和脯氨酸具有更鲜明的构象特征，在残基替换分析中也较多地被保留下来。
这种解释将模型的训练目标与序列组成联系起来：围绕结构预测反馈进行优化，会改变模型选择氨基酸的方式。
总结
这项研究把序列设计与结构预测连接得更紧密。LigandMPNN 提供结构条件下的序列生成能力，AlphaFold2 提供逐残基反馈，ResiDPO 再将这些反馈分配给需要学习和需要保留的位置。
在酶和蛋白质结合物两类任务中，这一训练方式都提高了结构筛选通过率，也让更多骨架在有限次数的采样中获得合适序列。
对实际设计流程而言，EnhancedMPNN 的价值在于改善序列生成这一环，提高后续结构筛选获得候选的效率。接下来的实验表征，可以进一步检验这些候选在表达、折叠以及目标功能上的表现。
tips：感觉有点幻觉模型的味道，使用结构预测模型的结果微调了一下mpnn，让生成的序列更符合af2的规则一些。
参考论文
Xue F, Kubaney A, Guo Z, Min JK, Liu G, Yang Y, Baker D. Improving Protein Sequence Design through Designability Preference Optimization. arXiv:2506.00297v1. 2025 年 5 月 30 日。