Cell｜王纪文/杨辉/王柠团队合作报道杜氏肌营养不良体内基因编辑首次人体试验，揭示肌肉编辑效果与免疫安全性挑战

杜氏肌营养不良症的体内基因组编辑疗法：临床前研究及首次人体试验

本研究描述了采用紧凑型高保真CRISPR-Cas12Max核酸酶（hfCas12Max）、通过单个AAV9载体递送的DMD体内基因组编辑疗法的转化开发与首次人体评估。在人源化DMD小鼠模型中，全身给药实现了基因组编辑、部分抗肌萎缩蛋白恢复及功能指标改善。在非人灵长类动物中，AAV9-hfCas12Max-G36产生了显著靶向编辑和药效学作用，但也观察到了免疫反应，且毒理研究规模有限，限制了其预测少见或宿主依赖性毒性的能力。在DMD受试者中，治疗后的骨骼肌活检提供了靶位点DNA编辑和相应转录本变化的分子证据，支持该策略在人类组织中的生物学活性。然而，临床发现也揭示了全身AAV基因组编辑治疗窗口的重要限制，尤其是肌肉编辑效率有限，以及较高临床剂量下发生了一例治疗相关致死性严重不良事件。

尽管人体骨骼肌中的编辑幅度有限，检测到基因组编辑仍确立了其生物学活性，并为后续优化提供了基础。与小鼠和非人灵长类动物相比，受试者中的编辑效率较低，可能反映了递送、靶组织生物学及疾病背景等多方面因素的共同影响。在载体转导层面，物种间AAV9受体利用、细胞进入及细胞内运输的差异，可能造成表达和编辑水平的变化。此外，患者营养不良肌肉中的慢性炎症、细胞外基质重塑及卫星细胞再生能力下降，可能限制载体分布及其接近靶肌纤维和卫星细胞的能力。骨骼肌的多核结构也可能构成额外障碍，因为有效恢复抗肌萎缩蛋白，可能需要在同一肌纤维的多个肌核中实现编辑。即使产生能够恢复功能的编辑，编辑频率、抗肌萎缩蛋白恢复与功能结局之间的关系，也可能存在延迟或呈非线性，尤其是在疾病较晚期或病情异质性较高的情况下。综合而言，要产生有意义的临床影响，需要提高相关肌肉细胞区室中的有效编辑，并改善对下游蛋白表达的预测能力。

多种策略可能通过增强肌肉递送、降低达到药效学作用所需的全身载体剂量，扩大治疗窗口。一种方法是使用具有更强骨骼肌嗜性的下一代AAV衣壳，例如MyoAAV和AAVMYO，从而可能在较低给药剂量下实现相当的组织暴露。如果这些工程化衣壳能够显著降低所需全身剂量，例如降至2.0×10¹²—1.0×10¹³ vg/kg，也可能减轻高全身载体负荷引起的先天免疫激活。其他策略包括优化转录调控，限制靶组织之外的表达并降低抗原负荷，例如使用肌肉限制性启动子或合成调控元件，包括MHCK7和SPc5-12；还可探索脂质纳米颗粒（LNP）等替代递送方式。此外，持续开发兼容单AAV递送的超紧凑CRISPR核酸酶，也为在较低载体剂量下提高肌肉编辑提供了机会。例如，近期通过工程改造获得的超紧凑Cas12f系统hpCasMINI仅含554个氨基酸，在维持较高特异性的同时，使哺乳动物细胞中的DNA切割活性最高提高19.5倍，并已通过单AAV递送在小鼠肝脏中获得体内验证。避免产生DNA双链断裂的替代编辑方式，或活性更高的变体，可能改变修复产物的分布，并进而改变风险特征。然而，这些策略在人类肌肉和全身给药条件下的总体效果仍不确定，需要谨慎评估。

体内基因组编辑的临床转化还需要仔细评估基因组特异性。本研究对hfCas12Max-G36的脱靶分析，结合了计算预测、全基因组无偏检测，以及跨多个实验系统的靶向验证。在所评估的候选位点中，均未观察到可检测的脱靶编辑。尽管部分预测位点位于已注释基因内，但在所测试条件下未发现这些位点的编辑证据，与hfCas12Max经工程优化后的高保真特性一致。不过，现有脱靶检测方法的灵敏度有限，不能排除低于检测限的罕见事件，或发生在未取样组织中的事件。持续开展长期监测并进一步改进检测方法，仍将是临床体内基因组编辑开发的重要组成部分。

这一小规模、开放标签队列中的功能结局存在异质性，两例受试者有所改善，另一例则表现为稳定或下降。鉴于仅三例可评估受试者中实现的基因组编辑和抗肌萎缩蛋白恢复程度有限，本研究不能支持关于临床疗效的结论。观察到的功能指标改善属于探索性发现，发生在伴随糖皮质激素治疗、基线异质性及DMD自然病程的背景下。因此，这些结果应被视为描述性和用于提出假设的发现，而非临床获益证据。这也强调，需要开展更大规模、具有对照且预先规定分析方法的研究，以确定分子编辑能否转化为一致且具有临床意义的功能改善。

第四例受试者的致死性严重不良事件强调，全身安全性，尤其是在较高AAV剂量下，仍是这一类疗法的核心限制。其迅速发展的临床过程，以及显著补体激活（sC5b-9＞1,800 ng/mL）和全身性细胞因子升高，与给药后短时间内发生严重先天免疫激活的表现一致。其他高剂量全身AAV基因治疗项目也曾报告类似免疫相关毒性。Lek等报道，一名27岁晚期DMD患者接受高剂量rAAV9基因治疗（1×10¹⁴ vg/kg）后死亡，患者在6天内发生ARDS，未见适应性免疫反应证据，提示可能存在细胞因子介导的毛细血管渗漏综合征。在另一种基于rAAV9的DMD疗法fordadistrogene movaparvovec的Ⅰb期研究中，Byrne等报告，22例受试者中有3例在1或3×10¹⁴ vg/kg剂量下发生补体激活和血栓性微血管病（TMA）。类似地，一例脊髓性肌萎缩伴进行性肌阵挛性癫痫（SMA-PME）患者接受高剂量AAV9-ASAH1基因治疗（2.2×10¹⁴ vg/kg）后死亡，也伴随显著补体激活（sC5b-9＞1,650 ng/mL）和细胞因子升高。

尽管这些病例涉及不同治疗方式，包括CRISPR基因组编辑、CRISPR转录激活（dSaCas9-VP64）及基因替代，它们共同支持高全身AAV暴露是先天免疫激活的重要促成因素。然而，不同个体的结局差异提示，既存炎症状态、心肺储备、体成分及早期体液免疫反应等宿主因素，可能影响补体和细胞因子反应的严重程度。

在Lek等报告的病例中，受试者基线左心室射血分数为55%—60%，瘦体组织占比仅为45%，这使人担忧：按总体重计算剂量，可能导致相对于瘦肌肉组织的载体暴露更高。在Byrne等的研究中，三例发生TMA的受试者在输注后最初1—2周内，抗AAV9中和抗体和总抗体均迅速升高，提示快速体液免疫反应可能参与了补体激活。在SMA-PME病例中，回顾性分析发现给药前已存在炎症状态，包括基线CD40L和IL-18升高，以及近期支气管充血，这些被认为可能促成随后发生的严重免疫反应。本研究第四例受试者的BMI为22.93，高于其他受试者，由此提出一种假设：基于总体重的给药，可能无法准确反映相对于瘦体重的有效载体暴露。这一观察仅用于提出假设，不能确立体成分对致死事件具有因果性贡献。

这些发现也支持进一步研究针对全身AAV反应所涉及先天免疫通路的免疫调节策略，包括使用补体抑制剂等补体靶向方法，通过AAV载体基因组工程减少胞嘧啶—磷酸—鸟嘌呤（CpG）基序或引入TLR9抑制序列，以及采用非病毒递送系统。这些方法需要谨慎评估，以确定其能否在不引入额外风险的情况下改善治疗窗口。

总体而言，本研究提供了CRISPR介导人骨骼肌体内基因组编辑的早期证据，并明确了基因组编辑疗法采用全身AAV递送时的关键效率与安全性限制。研究表明，扩大治疗窗口可能需要在较低全身剂量下提高递送效率，优化给药剂量计算方式，并更有效地减轻先天免疫毒性。要在DMD中实现持久临床获益，必须在可接受的安全性范围内，使分子编辑、蛋白恢复与功能结局相互衔接。

研究局限性

本研究存在若干局限。首先，临床发现受限于样本量较小且缺乏对照组，因此无法对功能疗效作出确定结论，也限制了对所观察临床变化的因果归因。尽管致死性严重不良事件与其他全身AAV基因治疗项目中报告的严重免疫介导毒性一致，但该事件仅发生于一名受试者，因此无法充分厘清剂量、载体暴露、基线临床状态及个体宿主易感性的相对贡献。

其次，虽然本研究提供了CRISPR介导人骨骼肌基因组编辑的直接分子证据，但实现的编辑效率有限，限制人类肌肉组织编辑效率的生物学因素仍未被充分理解。

第三，对致死性严重不良事件的解释不可避免地受到事后分析范围的限制。尽管这些分析提供了有价值的信息，但仍无法全面阐明所观察到的强烈补体和细胞因子激活背后的细胞触发因素及其时间顺序。此外，这项早期研究未纳入系统性心肺功能评估，限制了对治疗相关心肺效应的全面描述。

第四，尽管所采用的预防性免疫抑制方案与当前全身AAV基因治疗研究的实践一致，但其未能阻止一名受试者发生严重先天免疫激活；免疫抑制在多大程度上调节了所观察到的免疫反应，也仍不清楚。

第五，非人灵长类毒理研究每个剂量组仅包含两只动物，未具备检出少见、特异性或宿主依赖性毒性的统计能力。第四例受试者发生的严重急性先天免疫反应，说明小规模健康非人灵长类动物研究，在预测个体接受全身AAV后出现少见或宿主依赖性严重反应方面存在局限。

第六，虽然研究在机构审查委员会批准的方案框架内，由方案规定的安全审查委员会开展并记录了受试者之间的安全性审查，但该委员会未包含研究团队外部成员，研究设计中也未设置独立数据与安全监察委员会。未来研究将纳入独立外部安全监督。

最后，虽然受试者仍在持续进行的长期随访研究中接受观察，但本次分析主要基于截至第180天的结果，以及部分评估截至第360天的数据。仍需更长时间随访，以评价基因组编辑的持久性、长期抗肌萎缩蛋白表达及晚期安全性结局。