01 临床问题
图1｜多模态质谱‑荧光成像结合计算方法发掘斑块相关脂质的整体技术框架
一、现实问题
（1）Aβ斑块为阿尔茨海默病特征性病理标志物，但斑块并非仅为淀粉样蛋白的沉积集合体，斑块微环境伴随的脂质生化重编程机制尚未得到充分阐释。空间转录组技术可解析组织基因表达变化，但脂质分子的改变无法由基因表达谱直接推导；神经节苷脂、硫脂、溶血磷脂等脂质类别在AD病理进程中发生显著扰动，同时APOE、胆固醇脂筏、髓鞘硫脂均与阿尔茨海默病遗传风险及病理进展高度关联。
（2）大脑不同解剖区域（大脑皮层、海马、内嗅皮层、白质）对Aβ斑块病理损伤的易感性存在差异，既往研究尚未阐明形态学表型相近的斑块在不同脑区是否具备差异化的脂质分子表型；斑块内部同样存在分子异质性，该问题制约AD脂质生物标志物筛选与病理机制阐释。
二、研究难点
(1) 传统质谱成像技术的分子覆盖度有限，采用靶向分析、人工峰筛选的研究范式易引入主观偏倚，难以发掘未被报道的斑块相关脂质分子
(2) Aβ斑块尺寸多处于十至数十微米区间，常规质谱成像空间分辨率不足，易将斑块边界微环境信号平均化，丢失局部分子特征
(3) 神经节苷脂GM1a/GM1b属于同分异构体，二者质荷比完全一致，常规MS¹检测模式下会被合并为单一信号峰，无法实现区分
(4) 研究需同时实现全脑解剖区的宏观统计分析以及单斑块像素级的微观解析，还需完成荧光病理图像与质谱成像数据的坐标配准
(5) 仅依靠质谱成像仅可观测脂质丰度改变，无法区分脂质扰动源于溶酶体分解、合成酶活性变化或炎症介导的间接调控，需引入多组学手段完成上游驱动机制溯源。
02 研究方法
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实验动物：5月龄雌性5xFAD模型小鼠（n=6）及周龄性别匹配野生型小鼠（n=6）；7‑8月龄雌性APPNL‑G‑F敲入模型小鼠（n=7）；研究仅选用雌性个体，排除性别差异对斑块脂质谱带来的混杂效应。 -
组织样本：厚度12 μm脑组织冠状冷冻切片，贴附于ITO导电载玻片；DHAP作为基质开展MALDI‑2‑TIMS质谱成像；主要分析采用负离子采集模式，适配神经节苷脂、硫脂、磷脂酰肌醇类脂质的电离响应特征。 -
同源切片荧光数据：质谱成像采集完成后，同切片开展硫黄素S染色标记Aβ斑块、Hoechst标记细胞核，获取病理形态掩膜。 -
公共空间转录组数据集：5xFAD小鼠Visium空间转录组数据、APPNL‑G‑F小鼠多时间节点空间转录组数据集。 -
脂质注释与验证数据库：依托LIPID MAPS数据库开展脂质初步注释，结合组织原位MS/MS碎片信息完成分子结构佐证。
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多模态实验框架：MALDI‑2后电离技术提升低丰度糖脂类分子检测灵敏度；TIMS技术在离子进入飞行时间检测器前依据碰撞横截面积实现分离，拆分相同质荷比的脂质异构体；实验采用先质谱成像、后组织荧光染色的时序，降低基质洗脱对组织内分子的移位干扰，保障图像配准精度。 -
计算分析工作流：采用仿射变换算法完成荧光图像与质谱成像的空间配准；提取硫黄素S阳性像素定义为斑块像素；对照像素取自斑块向外扩张的环形区域，剔除全部硫黄素S阳性像素，规避斑块边缘信号对对照组造成污染；执行非靶向差异脂质筛选；结合t‑SNE降维、DBSCAN无监督聚类识别斑块内部分子亚群；构建随机森林模型，基于斑块脂质谱反向推断斑块所属脑区及海马亚区。 -
多组学整合框架：不局限于简单相关性分析，构建基因‑脂质共富集分数（log₂FCgene × log₂FClipid），将溶酶体降解基因（Hexa、Hexb、Ctsa）、鞘糖脂合成相关基因与斑块脂质变化进行配对比对，甄别与GM2、GM3蓄积相关性最高的调控通路。
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配准效果评估：采用Mander重叠系数，定量评价硫黄素S病理掩膜与GM3、硫脂ST脂质离子图像的共定位程度 
图2｜Aβ斑块的荧光与质谱成像验证斑块相关脂质改变 -
差异分子统计：Shapiro‑Wilk检验开展数据正态性校验，双样本t检验筛选斑块富集/耗竭的差异脂质分子。 -
分类模型性能评估：随机森林模型采用五折交叉验证，结合混淆矩阵、F1分数评估脑区、海马亚区的分类区分效能。 -
异构体结构确证：TIMS依据离子迁移率分离GM1a/b异构体后执行组织原位TIMS‑MS/MS检测；利用前体离子迁移特征传递至碎片离子的特性，依靠特征诊断碎片离子确定唾液酸的糖链连接位点，完成异构体结构鉴定。
03 研究设计
一、数据集
质谱成像数据集：同一批组织切片设置三套成像空间尺度，5 μm分辨率解析斑块微环境、10 μm分辨率解析海马亚区特征、50 μm分辨率获取全脑水平整体变化趋势。
荧光成像数据集：同源切片硫黄素S斑块染色、Hoechst细胞核染色图像。
转录组数据集①：7月龄5xFAD小鼠Visium空间转录组公共数据集。
转录组数据集②：APPNL‑G‑F小鼠多时间节点公共空间转录组数据集；本研究配套完成APPNL‑G‑F模型的脂质质谱成像，实现脂质组与敲入模型转录组的匹配，两套模型并未执行完全统一的实验方案。
二、验证安排
技术体系验证：选取已报道的斑块相关脂质GM3、硫脂ST验证图像配准与分子共定位效果；通过MS/MS完成脂质结构辅助鉴定；同步直接MALDI检测Aβ多肽，与硫黄素S荧光信号比对，证实荧光标记对Aβ斑块识别的特异性。
跨模型机制验证：分别在5xFAD与APPNL‑G‑F两套模型中执行基因‑脂质共富集分析；Hexa/GM3、Hexb/GM3的共富集关联在两套模型中均稳定复现，以此支撑溶酶体降解参与脂质蓄积的推论，规避单一转基因模型过表达效应造成的结果误判。
空间层级递进验证：由全脑层面筛选脂质扰动显著的脑区，下沉至海马DG/CA3/CA1/下托亚区开展对比，最终到达单斑块像素层级解析斑块内部分子亚群。
异构体专项验证：TIMS迁移谱对GM1(36:1)实现双峰分离；迁移率更低的组分归属GM1b，迁移率更高组分归属GM1a；经MS/MS完成结构确认后，开展二者空间成像比对。
04 主要结果
05 学习借鉴
一、方法层面
形态引导质谱成像范式：优先完成质谱信号采集，同源切片后续开展病理荧光标记，通过配准将病理结构直接作为感兴趣区掩膜；无需组织解离与激光显微捕获，完整保留组织原位化学微环境信息。
多分辨率成像策略：50 μm大像素保障群体统计效力，5 μm高分辨率解析微观病灶机制，多尺度图像溯源至同一组织样本，规避全脑平均分析掩盖斑块局部信号。
无监督聚类结合监督分类的分析逻辑：依靠DBSCAN、t‑SNE无监督算法发现病灶内部潜在分子亚群；进一步利用随机森林监督模型，定量评估分子特征对亚群、脑区的区分效能，相比单一PCA分析更利于病理异质性解析。
转基因‑敲入双动物模型交叉验证：核心机制结论不依赖单一转基因过表达模型；病理进程更贴近生理状态的敲入模型结果复现，方可给出倾向性的机制推论。
二、研究设计层面
分层递进空间解析策略：分析层级沿全脑解剖区‑脑内亚区‑海马亚区‑单斑块像素逐级下沉，各层级对应独立科学问题，避免组织异质性被整体均值掩盖。
基因‑脂质共富集分数计算方法：将公共空间转录组作为上游假说挖掘工具，利用log₂FC乘积实现基因‑脂质配对，相比简单相关性分析具备更强的抗噪声能力。
将异构体解析纳入质谱成像分析流程：对于质荷比完全重合的分子，不默认归为同一物质；引入TIMS增加碰撞截面的分子分辨维度，提升质谱成像的分子解析深度。
06 专科迁移
神经退行性疾病（帕金森病、额颞叶痴呆）：针对路易小体、TDP‑43蛋白包涵体，可采用荧光标记病理包涵体结合MALDI‑2‑TIMS质谱成像与图像配准的完整流程，探究病理病灶周边脂质、代谢物是否同样存在脑区特异性改变。
肿瘤研究领域：借助免疫荧光标记肿瘤巢、肿瘤浸润边界、坏死病灶；与质谱成像结果配准，解析脂质、药物分子、代谢物的空间边界特征；依托TIMS完成脂质异构体、药物手性异构体区分。
炎症与纤维化研究：荧光标记炎症病灶、纤维化结节，质谱成像解析病灶原位代谢重编程，结合公开空间转录组数据集完成上游通路溯源。
药物组织分布评价：同源切片同步开展病理染色与质谱成像，同时观测药物分子分布与内源性脂质扰动；实施时需关注基质体系兼容性，确认待测药物分子处于MALDI电离适配范围。
基础组织生物学研究：该工作流可拓展至任意可荧光标记特定细胞、特定组织结构的样本，实现形态学引导下的原位空间脂质组研究。
07 原文与复现入口
编辑：田雨鑫
审核：吴朝
