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我们在高分文章中经常看到下图这样的亚细胞定位组合图，图中不仅有多通道的荧光显微照片，还有荧光强度折线图，非常精美！那么，如何制作这般专业的组合图？
首先通过 File/Open 分别打开各个单通道荧光图片，通过 Image/Color/Merge Channels 可得到融合图像。这里在弹出的 Merge Channels 选项窗口中，将 C2 (green) 设为 GFP 图、C4 (gray) 设为明场图、C6 (magenta) 设为 FM4-64 图，其余通道保持为 None，勾选 Keep source images，点击OK即可得到融合图。
最后得到融合效果如下，具体方法参考《如何进行亚细胞定位荧光照片融合？》一文。
为了让强度曲线的横轴显示真实的物理距离（μm），需要先为图片设置标尺。选择工具栏中的直线工具，沿照片右下角的标尺（Scale bar）画一条与其等长的线段（本例标尺代表 10 μm）；然后通过 Analyze/Set Scale，在 Known distance 中填入10、Unit of length 填入 μm，软件便会自动计算出比例尺（本例为 7.5 pixels/μm），勾选 Global 可将该标尺应用到所有已打开的图片。
接下来是荧光强度分析。选择工具栏中的直线工具（Straight Line），在感兴趣的区域沿测量路径画一条直线（即示例图中黄色虚线箭头所在的位置）。然后通过Analyze/Plot Profile（快捷键：Ctrl+K）进行灰度分析。
由于这里对多张照片的同一位置进行分析，因此可先通过 Image/Stacks/Images to Stack 将多张图片堆栈（Stack），拖动窗口下方滑块切换到对应通道，再分别执行 Plot Profile，逐一导出各通道的灰度数据，详细步骤请参考《如何进行荧光共定位分析？》一文。
为了让读者清楚测量的起点与方向，需要在融合图上用黄色虚线箭头标出测量路径，并在起点标注 “S”。这一步可以在 Illustrator 中完成：用直线段工具画一条线段，在“描边”面板中将其设为虚线、颜色设为黄色，为末端添加箭头，再用文字工具添加“S”，如下图。
相同的方法，可对水稻原生质体的荧光照片进行合并通道（如下图）、设置标尺、计算灰度、添加划线等，此处不再赘述。
从 ImageJ 得到的是各通道的灰度数据，我们还需要把强度曲线重绘成与荧光颜色一致的折线图。将各通道的数据录入GraphPad Prism，X列为距离 Distance（μm），Group A为 FM4-64（品红）、Group B 为 OsDRP1C-GFP（绿色），数据类型选择 XY。
在左侧导航栏 Graphs 中选择 Data 1，图表类型选择折线图，即可看到绘制结果。双击折线调整粗细和颜色，颜色与荧光通道保持一致（FM4-64 为品红、GFP 为绿色），双击坐标轴标题，将其修改为 “Fluorescence Intensity” 和 “Distance from S (μm)”，如下图，随后导出图片备用。
通过文件/新建（快捷键：Ctrl+N）创建一个 A4 大小的空白画板：方向选择纵向，宽度 210 mm、高度 297 mm，颜色模式为 RGB，光栅效果为高（300ppi），点击创建空白文档。
本例共有 8 张显微照片，需要排成 2 行 4 列，可借助直线工具组中的矩形网格工具快速搭建排版参考线。选择该工具后在画板上拖出一个矩形，在弹出的“矩形网格工具选项”中，将水平分隔线数量设为 1、垂直分隔线数量设为 3，即得到 2 行 4 列的网格。
通过文件/置入命令，可批量导入事先准备好的荧光照片。需要注意的是，照片默认以链接方式置入，修改原文件时组合图会同步更新，如需断开链接，可在置入后点击控制面板的嵌入。
按照网格参考线，依次在每个单元格内拖动鼠标绘制置入区域，所选照片会依次置入到对应区域中。
也可全部置入后，用选择工具框选照片，通过 对象/变换/缩放 将照片统一缩放到合适大小，使其恰好填满各自的网格单元，避免出现大小不一的情况。
打开对齐面板（窗口/对齐），选中同一行的照片，先做顶对齐或底对齐，再做水平居中分布；选中同一列的照片做垂直方向的对齐与分布，使各照片间距均匀、上下左右对齐，形成高分图那种舒服的“透气感”。 同样，把两张荧光强度折线图置于组合图下方，并做最后的对齐微调。
最后，使用文字工具添加列标题和分图序号，字体这里统一选用 Arial。文本只需输入一个，然后按住 Alt 键用选择工具拖动即可快速复制多个，再逐一修改即可。
检查图片位置、序号等是否对齐，确认无误后，通过文件/存储为（快捷键：Shift+Ctrl+S）可保存为 Ai 工程文件和 PDF 文件。
好啦，本次的荧光强度分析组合图制作教程就分享到这里啦！
Li, Mengzhen, et al. "OsDRP1C mediates root development by modulating OsPIN1 cycling in rice." New Phytologist.
https://doi.org/10.1111/nph.71625
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