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传统组织学依赖物理切片，只能获取2D平面信息，难以还原细胞与结构的真实空间关系。组织透明化技术的出现彻底改变了这一局面——通过去除脂质和色素，匹配折射率，使原本不透明的器官变得透明，再结合光片显微镜、共聚焦显微镜等，即可实现从整体器官到亚细胞分辨率的三维成像。这一技术已广泛应用于神经环路追踪、肿瘤转移分析、发育生物学和药物递送研究，让研究者能够在完整器官中追踪单个轴突、可视化血管网络、定量干细胞分布，真正实现“看透”生命的三维架构。
在众多透明化方法中，PEGASOS展现出独特优势。2018年发表于《Cell Research》的研究证明，PEGASOS可透明化几乎所有组织类型，包括骨、牙齿等传统方法难以处理的硬组织，以及脑、肝、脾、肾等软组织。与Bone CLARITY仅适用于骨、CUBIC-R仅适用于软组织、uDISCO对高色素器官效果有限不同，PEGASOS首次实现了“无盲区”全身成像。更重要的是，该方法能有效保护内源性荧光信号，兼容免疫荧光染色。另外，PEGASOS及其衍生的TESOS技术，是目前唯一能在组织透明化后实现“边切边拍”的透明化方案。TESOS在PEGASOS透明化基础上，借助紫外进行包埋，使样本可以变得高度透明，且坚硬，实现从全脑成像到单轴突追踪的多尺度研究。
PEGASOS把组织变成了一块透明“玻璃”，但要把里面的细胞、血管、神经看清楚，还需要一把特殊的“光刀”——这就是光片显微镜。传统显微镜好比拿手电筒从正面硬照，光一路穿过去，样品容易褪色、受伤，越深越模糊。光片显微镜则像用一把极薄的光刀从侧面轻轻“片”开样品，只点亮当前想看的那一层，旁边的组织完全不受打扰。于是，它既能像CT一样逐层扫描，又像在清水里看鱼群，几小时就能把全肺、全脑甚至全身拍个遍。透明化加光片，一个负责把“毛玻璃”变清，一个负责把里面照透，堪称三维成像的黄金搭档。
这里我们分享几篇结合PEGASOS+光片显微镜进行大组织3D成像的代表性研究，涉及的领域包括大脑、类器官、骨骼和其它外周脏器。
一、大脑中的应用
PEGASOS透明技术结合光片显微镜进行三维成像，可用于观察全脑血管网络、追踪神经纤维走向、评估基因递送是否到达脑内皮细胞、重建脑血管畸形、研究脑肿瘤与周围组织的关系，为脑发育和脑血管疾病研究提供三维工具。本次介绍的是2025年发表于Nature Biomedical Engineering的一篇文献，主要涉及脑内皮细胞基因递送载体和脑血管畸形建模的研究。
主要研究内容：开发重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）迷你脑内皮系统（rAAV-based mini-system for brain endothelial cells, rAAV-miniBEND）。利用Tek基因最小启动子和优化顺式元件，实现脑内皮细胞高效特异基因表达。可通过颅内或静脉注射，在不同发育阶段靶向小鼠和大鼠脑内皮细胞。利用该系统表达丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（ MAP3K3）^I441M和B-Raf原癌基因（BRAF）^V600E，成功构建脑海绵状血管畸形和脑动静脉畸形模型，揭示BRAF突变驱动血管扩张和内皮细胞增殖，并验证维莫非尼（vemurafenib, PLX4032）可抑制畸形进展。
透明化3D成像的应用：采用PEGASOS透明化全脑及脑血管，结合光片显微镜进行三维成像。脑组织脂质丰富、不透光；PEGASOS实现全脑透明化，保留EGFP和tdTomato荧光，清晰显示腺相关病毒在脑内皮细胞的特异性表达。三维重建脑血管畸形结构为脑血管疾病建模和基因治疗提供全脑尺度三维验证工具。
图1：PEGASOS透明化后全脑、非AVM区与AVM区血管光片成像
图2：经透明化处理的 Braf-CAfl/fl::Ai14 小鼠脑组织（感染 AAV-miniBEND-Cre）的全脑血管及畸形血管图像。
a，示意图展示 AAV 注射流程以及基于 PEGASOS 的全脑透明化方法。采用光片显微镜对全脑血管进行成像。右侧展示全脑血管图像全景。b，箭头标注存在畸形血管的代表性区域。包含对应脑组织块的两张样本帧图像与一张三维图像。
视频1：基于PEGASOS透明化和光片显微镜的全脑血管3D重建视频，展示正常脑区与AVM病变区的血管形态差异，包括畸形血管的扩张和异常连接。
二、类器官中的应用
类器官现有成像手段主要有二维切片、共聚焦显微镜、流式细胞术和活细胞成像等。二维切片会破坏整体结构，只能观察局部；共聚焦受穿透深度限制，深部信号衰减且光毒性较大；流式细胞术虽能定量，却丢失空间位置信息；活细胞成像难以解析内部复杂层次。透明化结合光片显微镜可有效克服这些不足：透明化通过降低组织散射，使类器官整体透明；光片仅激发焦平面，速度快、光毒性低，能对完整类器官进行三维扫描，保留空间信息，清晰展示分层结构、细胞分布及多组织共发育，尤其适合直径达数毫米的复杂类器官。本次介绍的这篇是2025年发表于Nature Protocols杂志的一项工作，主要涉及“心脏+血液”共发育模型类器官的制备及先进成像样本处理的研究。
主要研究内容：建立14天分化方案，从人类多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPS）生成“心脏+血液”共发育模型类器官（blood-generating heart-forming organoids, BG-HFOs），模拟心脏、血管和造血系统共发育。BG-HFOs由内层核心（inner core, IC）、心肌层（myocardial layer, ML）和外层（outer layer, OL）组成，外层含造血内皮（hemogenic endothelium, HE）和造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells, HPCs），可分化为红系、髓系和淋巴系。优化Wingless相关整合位点（Wingless-related integration site, WNT）通路调控和细胞因子组合，并开发全mount免疫荧光染色，用于三维形态分析。
透明化3D成像的应用：采用PEGASOS透明化复杂多组织类器官，结合光片显微镜进行三维成像。类器官直径可达4毫米，包含心脏、内皮和造血组织，密度不均；PEGASOS能透明化最大4毫米的BG-HFOs，保留NKX2.5-EGFP等转基因信号，兼容免疫荧光染色。相比甲基水杨酸/苯甲酸苄酯（MSBB）透明化，PEGASOS更好保留转基因荧光，提供快速31小时透明化流程，适用于高通量筛选，为类器官形态学分析提供高效方案。
图3：全mount免疫荧光染色与透明化流程，其中蓝色路径为PEGASOS
图4：PEGASOS透明化后保留转基因信号（NKX2.5-eGFP）的类器官成像
视频2：经 PEGASOS 透明化处理的 BG-HFO 样品共聚焦成像后采集的 Z 层堆叠图像。NKX2.5-eGFP（绿色），CD31（红色），DAPI（蓝色）。比例尺，500 微米。
三、骨研究中的应用
传统骨研究依赖micro-CT、组织切片和共聚焦，前者无荧光细胞信息，切片破坏三维结构，后者穿透深度有限。PEGASOS可透明化骨和牙，保留荧光并兼容免疫染色，结合光片显微镜三维重建完整股骨、下颌骨、牙和膝关节，观察骨小梁、骨髓腔神经与血管，为骨发育和骨髓微环境研究提供三维工具。本次介绍的这篇是2025年发表于Advanced Science杂志的一项工作，主要涉及阳离子肽模拟物系统性体内软骨靶向的研究。
主要研究内容：报道富含N-取代丁基氨基甘氨酸（N-substituted butyl-amino glycine, Nlys）的阳离子肽模拟物，通过静电结合软骨糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG），抵抗蛋白酶降解。设计多种序列，Cy5-(NlysO)₇（O为羟脯氨酸，hydroxyproline）血清稳定性和软骨穿透最佳，可穿透1毫米厚软骨，24小时稳定滞留。静脉注射后靶向全身软骨，包括关节、肋软骨、气管、耳和脊柱。在老年小鼠和类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）模型中检测GAG丢失，制备生物素偶联物，证明可递送小分子药物。
透明化3D成像的应用：采用PEGASOS透明化软骨、骨及关节等硬组织，结合光片显微镜进行三维成像。硬组织因钙化和胶原密集，传统透明化难处理；PEGASOS能透明化软骨和骨，保留Cy5荧光，实现全关节和脊柱三维整体成像。可观察阳离子肽在毫米级软骨中的穿透深度和分布，同时显示GAG分布，使系统给药后全身多部位软骨同时成像成为可能，为软骨靶向递送提供直观三维证据。
图5： e. 前爪、膝关节、脊柱光片图像显示Cy5-(NlysO)₇软骨摄取；g. 新生小鼠全身3D光片图像；h. 局部解剖结构2D光片视图。
图6：b. 年轻与年老小鼠膝关节光片图像显示GAG丢失；e. CAIA模型后爪3D光片扫描。
视频3：透明化软骨组织3D光片成像，显示Cy5-(NlysO)₇在软骨中的分布。
四、其它外周脏器中的应用
透明化结合光片显微镜的3D组织成像也适合肺、肝、肾等各种外周脏器，可评估载体分布、药物递送和组织结构。本次介绍的这篇是2025年发表于ACS Nano杂志的一项工作，主要涉及肺靶向和滞留纳米纤维治疗孤立性TNBC肺转移的研究。
主要研究内容：开发肽基纳米纤维（peptide-based nanofibers, pNFP）优化型pNFP6。pNFP6由赖氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-亮氨酸（Lys-Leu-Asp-Leu, KLDL）自组装域和聚肌氨酸（polysarcosine, Psar）组成，宽5纳米、长8微米，表面正电荷。静脉注射后75%剂量4小时聚集于肺，形成微米级纤维网络，滞留超2周。负载阿霉素衍生物aldoxorubicin（aldox），酸敏感腙键连接，肿瘤酸性微环境释放。在MDA-MB-231（人TNBC细胞系）肺转移模型中，aldox-pNFP6抑制肿瘤生长，中位生存期81天，优于游离阿霉素（doxorubicin, Dox）和聚乙二醇化脂质体阿霉素（PEGylated liposomal doxorubicin, Doxil），降低心脏和血液毒性。
透明化3D成像的应用：采用PEGASOS透明化全肺，结合光片显微镜进行三维成像。肺组织含气、血管丰富，传统切片难窥全貌；PEGASOS能把全肺变透明，保留Cy5.5荧光，实现无偏采样，定量纳米纤维在肺泡和转移灶周围的簇集与分布。同时显示纳米纤维与肿瘤细胞，为肺靶向递送提供高分辨率三维视角，直观评估载体肺内滞留与释药行为。
图7：a. PEGASOS透明化流程示意图；b. 透明化后肺组织荧光图像；c. 光片显微镜全肺三维成像；d. 肺泡区域高倍成像；e. 3D分割用于定量分析；f. 纳米纤维簇集大小定量；g. 荧光强度定量。
视频4：LSFM 3D重建全肺，显示PBS、Cy5.5-pNFP12和Cy5.5-pNFP6分布。
视频5：LSFM 2D fly-through，显示纳米纤维在肺泡结构中的沉积与分布。
视频6：LSFM 3D重建肺叶，显示aldox-pNFP6释放的Dox在转移灶内的分布。
透明化结合光片显微镜的3D组织成像也适合主动脉等外周脏器，可评估淋巴管、血管和免疫细胞的空间关系。以下这篇是2025年发表于Cardiovascular Research杂志的一项工作，主要涉及主动脉周围淋巴管通过动员免疫反应保护胸主动脉夹层的研究。
主要研究内容：研究主动脉周围淋巴管在胸主动脉夹层（thoracic aortic dissection, TAD）中的作用。发现TAD患者和小鼠中主动脉周围淋巴管数量减少、功能受损。通过遗传谱系示踪和成像，鉴定气管支气管淋巴结（tracheobronchial lymph node, TLN）为胸主动脉主要引流淋巴结。淋巴缺陷加重TAD，而血管内皮生长因子C Cys156Ser突变体（vascular endothelial growth factor-C Cys156Ser, VEGF-C156S）促进淋巴管生成可抑制TAD。单细胞测序显示淋巴内皮细胞（lymphatic endothelial cells, LECs）通过C-X-C基序趋化因子配体12/C-X-C趋化因子受体4（C-X-C motif chemokine ligand 12/C-X-C chemokine receptor type 4, CXCL12-CXCR4）招募免疫细胞，阻断该通路可消除保护作用。
透明化3D成像的应用：采用PEGASOS透明化主动脉及周围淋巴管，结合光片显微镜进行三维重建。主动脉壁厚、周围脂肪和淋巴管交织；PEGASOS实现主动脉及周围淋巴管全mount透明化，保留Lyve1（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1）、CD31（cluster of differentiation 31）等免疫荧光信号。清晰显示淋巴管网络和免疫细胞，克服传统切片对淋巴管三维结构观察的局限，可定量淋巴管数量和形态变化，为研究淋巴管在主动脉疾病中的作用提供有力证据。
图8：对照组与TAD小鼠主动脉全mount免疫染色（CD31/Lyve1）
图9：主动脉及引流淋巴结3D重建
图10：LEC^WT与LEC^KO小鼠主动脉全mount免疫染色
图11：hVEGF-C156S处理组主动脉全mount免疫染色
视频7：Ctr主动脉全mount CD31/Lyve1免疫染色3D重建
视频8：TAD主动脉全mount CD31/Lyve1免疫染色3D重建
视频9：主动脉及周围淋巴管3D重建
视频10：OVA488淋巴引流动态，为功能验证视频
PEGASOS组织透明化技术突破了传统切片仅能获取2D信息的局限，可透明化骨、牙等硬组织及脑、肝等软组织，实现全身“无盲区”成像，并保护荧光信号、兼容免疫染色。结合光片显微镜，以极薄光刀逐层扫描，避免样品损伤，实现从全器官到亚细胞分辨率的三维成像，已广泛应用于神经、肿瘤、发育等研究。
END
撰文：刁昕
编辑：鄢盛尧
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