动物细胞免疫共沉淀（Co-IP）实验操作
实验类型：蛋白质相互作用检测
适用样本：哺乳动物培养细胞
检测方法：免疫共沉淀结合 Western Blot
你从培养箱里取出一皿细胞，裂解后得到一管含有数千种蛋白质的混合液。现在想回答一个问题：目标蛋白 A 和候选蛋白 B 是否存在相互作用？
免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）就是解决这类问题的常用方法。
实验中，你利用特异性抗体识别目标蛋白 A，再借助 Protein A/G 磁珠把 A 及其结合的蛋白复合物一起富集出来。随后进行蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB），检测沉淀物中是否含有候选蛋白 B。
如果 B 随着 A 一起被富集，而且阴性对照中没有对应信号，就说明二者在当前实验条件下存在可检测的蛋白关联。
这里需要明确一个概念：
Co-IP 检测到的是蛋白质之间的共沉淀关系。A 和 B 可能直接接触，也可能通过第三种蛋白共同形成复合物。
Co-IP 阳性支持二者存在蛋白复合物关联，直接结合需要其他实验进一步验证。
本文采用哺乳动物培养细胞作为实验体系，以 HEK293T 贴壁细胞为示例，建立一套使用温和非变性裂解液、Protein A/G 磁珠及 Western Blot 检测的标准操作流程。
该流程也可以作为 HeLa、A549、HCT116 等常见哺乳动物细胞的起始方案。
不同细胞系的蛋白表达量、裂解效率及目标复合物稳定性存在差异，正式实验前需要进行小规模条件验证。
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本实验利用免疫共沉淀技术，检测哺乳动物细胞内目标蛋白 A 与候选互作蛋白 B 的关联情况。
通过富集目标蛋白 A，并检测沉淀复合物中的候选蛋白 B，你可以判断两种蛋白在细胞裂解条件下能否共同被沉淀。
结合输入样本、同型对照抗体以及必要的反向免疫共沉淀实验，还可以进一步评估蛋白富集效率、非特异性结合及实验结果的重复性。
对于研究蛋白复合物组装、细胞信号转导、蛋白定位与功能调控的课题，这套实验可以提供重要的生化证据。
蛋白 A 和蛋白 B 在细胞内形成了一个复合物。
加入温和裂解液以后，细胞膜逐渐被破坏，部分蛋白质复合物进入可溶性裂解液。只要裂解条件没有显著破坏 A 与 B 之间的结合关系，它们就可能继续以复合物形式存在。
随后加入能够识别 A 的特异性抗体。
抗体与 A 结合后，再利用 Protein A/G 磁珠捕获抗体及其结合的蛋白复合物。磁力架将磁珠吸附到离心管侧壁，未结合的蛋白质则随上清被移走。
经过数轮洗涤，磁珠上留下经过富集的目标蛋白 A 及其共同沉淀的蛋白。
Co-IP 原理示意图。A 为诱饵蛋白，B 为候选共沉淀蛋白；图中为概念性示意，未按分子比例绘制。
问题来了，为什么我们要使用温和裂解液？
因为蛋白之间的相互作用依赖多种非共价作用力，包括氢键、静电作用及疏水作用。某些强裂解条件会使蛋白质变性，或者让原先结合的复合物解离。
因此，常规 Co-IP 优先采用温和的非离子型去污剂，如 Triton X-100 或 NP-40 替代品。它们有助于释放可溶性蛋白，同时尽量保留可检测的蛋白复合物。
磁珠表面、抗体以及某些高度黏附性的蛋白之间，也可能出现非特异性结合。
假设 Western Blot 显示，在目标抗体组中检测到了蛋白 B。单看这一条条带，我们还无法确定 B 是被 A 特异性带下来的，还是自己黏在磁珠或抗体上。
这时，同型 IgG 对照就派上了用场。
IgG 对照使用与实验抗体相匹配的非相关免疫球蛋白，保持相同的裂解液、蛋白总量、磁珠用量和洗涤条件。它可以帮助你判断候选蛋白是否具有非特异性沉淀倾向。
如果候选蛋白 B 在特异性抗体组明显富集，而 IgG 对照中的信号很弱或不可检测，就能为 Co-IP 的特异性提供支持。
在开始培养细胞之前，先把实验分组定下来。本文以检测细胞内源性蛋白 A 与蛋白 B 的关联为例。
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其中 Input 是免疫沉淀前留取的总蛋白样本。它能够告诉你蛋白 A 和 B 在原始细胞裂解液中是否存在，以及它们的表达量是否发生变化。
反向 Co-IP 则交换诱饵蛋白与候选蛋白的角色。当你用抗 B 抗体沉淀 B 时，观察能否再次检测到 A。这能够增强相互作用结论的可信度，但反向实验失败也可能与抗体、表位遮挡及结合效率有关。
如果你使用外源表达系统，例如 Flag-A 和 HA-B，还应设置空载体或单独表达对照。这样可以排查标签、抗体及外源表达背景所带来的额外信号。
建议每项正式生物学比较至少安排 3 次独立培养、独立收样的生物学重复。每次重复均保留必要的阴性对照。
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我们先处理裂解液。
本方案NaCl 150 mM，保留 0.5% Triton X-100，使用中性偏弱碱性的 Tris-HCl 缓冲体系。常规起始配方不添加 DTT 和 MgCl₂。
以下按配制 50 mL 缓冲液计算。
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配制时，依次加入 Tris-HCl、NaCl、EDTA、甘油和去污剂，充分混匀后用超纯水定容。预冷至 4°C，并在正式裂解前加入蛋白酶抑制剂。
若使用 100 mM PMSF 储备液，按每 1 mL 裂解液加入 10 μL 配制，可得到约 1 mM 的最终浓度（准确计算需考虑加入后的总体积）。PMSF 容易水解，应在使用前加入，并按化学品安全规范操作。复合型蛋白酶抑制剂的具体加入量以产品说明书为准。
如果研究的是蛋白磷酸化依赖性相互作用，建议同时加入磷酸酶抑制剂。
注意，EDTA 会络合二价金属离子。对于依赖 Ca²⁺、Mg²⁺ 或其他金属离子的蛋白相互作用，应考虑去除 EDTA，并根据蛋白性质重新优化缓冲液。膜蛋白复合物、核蛋白复合物也可能需要不同的裂解策略。
初次实验可以直接使用上述 Co-IP 裂解缓冲液作为洗涤液。这样做有一个好处：蛋白复合物从裂解到洗涤，始终处于相近的离子强度与去污剂环境中。
当 IgG 对照出现较强的非特异性结合时，再尝试提高 NaCl 至 200–300 mM，或调整洗涤次数。每次只调整一个主要参数，便于判断变化来源。
免疫沉淀结束后，本文采用 SDS 上样缓冲液直接洗脱磁珠上的蛋白复合物。
若使用 4× SDS 上样缓冲液，按照 1 份 4× 缓冲液与 3 份样本或稀释液混合，获得 1× 最终浓度。
对磁珠直接洗脱时，可加入 30 μL 1× SDS 上样缓冲液。该方案主要适用于后续 Western Blot 检测。若需要进一步进行质谱分析，应另外选择与质谱样本制备流程兼容的洗脱方式。
以下按照实验实际进行的时间顺序展开。
默认实验条件为：每个免疫沉淀反应加入 500 μg 总蛋白，反应体积 500 μL，使用 2 μg IP 抗体和 25 μL Protein A/G 磁珠原始悬液。
上述参数适合作为常规内源性 Co-IP 的初始测试条件。实际抗体结合能力、磁珠捕获容量和目标蛋白丰度均需结合产品说明书确定。
细胞接种
将状态良好的 HEK293T 细胞接种于 10 cm 培养皿中，加入约 10 mL 完全培养基。
置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中培养。
待细胞融合度达到约 70%–90% 时收样。尽量避免过度融合、明显脱落或大量死亡的细胞进入实验。
一个 10 cm 培养皿所能提供的可溶性总蛋白量取决于细胞密度、培养状态与裂解条件。正式实验应通过 BCA 测定实际蛋白浓度，再决定每皿细胞可支持多少个免疫沉淀反应。
实验分组准备
准备至少两组免疫沉淀样本，分别用于特异性抗体 IP 和同型 IgG 对照。
对于每一个反应，计划使用 500 μg 总蛋白。
例如，你准备检测蛋白 A 与蛋白 B 的相互作用，需要进行 IP:A 和 IP:IgG 两组。那么两组共需要至少 1000 μg 可用于免疫沉淀的总蛋白，此外还应额外留出 Input、蛋白定量和操作损耗所需样本。
预冷实验耗材
提前将 PBS、Co-IP 裂解液、低蛋白吸附离心管和磁珠洗涤缓冲液放置于 4°C。
开启冷冻离心机，将温度设置为 4°C。
准备冰盒，并检查磁力架、端对端旋转混匀仪是否正常工作。
从细胞收样开始，尽量保持样本处于低温环境。后续抗体孵育和磁珠捕获均在 4°C 进行。
去除培养基
将培养皿从培养箱中取出，置于冰上。
沿培养皿边缘缓慢吸去培养基。
加入 5 mL 预冷的 1× PBS，轻轻晃动培养皿，使 PBS 覆盖全部细胞表面。
随后吸去 PBS。
PBS 清洗可以去除残留培养基、血清蛋白和其他可溶性杂质，减少它们进入裂解液。
加入 Co-IP 裂解液
向每个 10 cm 培养皿加入 500 μL 预冷的 Co-IP 裂解液。
将培养皿放在冰上，孵育 10–15 min。
孵育过程中，每隔约 5 min 轻轻晃动培养皿，使裂解液充分覆盖细胞。
你会观察到，细胞边界逐渐模糊，细胞层开始松散。部分细胞可能仍附着于培养皿底部，这时需要继续使用细胞刮刀辅助回收。
提示
这里建议避免直接加入含高浓度 SDS 的常规强变性裂解液。
SDS 会破坏大量非共价蛋白相互作用，使后续 Co-IP 的检测结果受到影响。
收集细胞裂解液
使用细胞刮刀，沿培养皿底部轻轻刮取细胞。
将细胞悬液转移至预冷的 1.5 mL 离心管中。
在冰上继续放置约 5 min，期间轻轻颠倒混匀 2–3 次。
如果裂解液明显黏稠、吸头很难吸起液体，通常意味着细胞释放的核酸增加了体系黏度。
这种情况可以考虑适当增加裂解液体积，或经过验证后使用核酸酶处理。针对核酸依赖性蛋白复合物，需要谨慎使用核酸酶，因为它也可能破坏你希望检测的关联。
常规 Co-IP 不建议一开始就进行强烈超声处理，过度机械剪切可能影响部分不稳定的蛋白复合物。
离心去除不溶性杂质
将裂解液放入预冷至 4°C 的离心机。
设置离心参数：
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离心结束后，可以观察到管底出现细胞碎片及其他不溶性物质形成的沉淀。
使用移液器缓慢吸取澄清上清，转移至新的预冷离心管。
吸取过程中，将吸头停留在沉淀上方，避免碰触管底沉淀。
这部分上清就是后续进行 Co-IP 的可溶性蛋白裂解液。
提示
注意，该方法主要分析温和裂解条件下能够进入上清的蛋白质。
对于难溶性膜蛋白、细胞骨架相关蛋白或染色质结合蛋白，需要单独验证目标蛋白是否已被有效提取。
BCA 蛋白定量
从澄清后的蛋白裂解液中取少量样本，按照 BCA 试剂盒说明书配制标准曲线和检测体系。
根据样本吸光度计算蛋白浓度。
例如，测得蛋白浓度为 2 mg/mL，则 250 μL 裂解液中含有：
RIP = IB,IP / IA,IP
这意味着每个 IP 反应取 250 μL 裂解液，便可获得计划使用的 500 μg 总蛋白。
蛋白定量时，标准品最好与样本具有相近的缓冲液背景。尤其是去污剂或还原剂浓度较高时，应核对其是否处于 BCA 试剂盒允许范围内。
调整各组蛋白总量
根据定量结果，分别取含有 500 μg 总蛋白的细胞裂解液，加入标记好的 IP 离心管。
使用预冷的 Co-IP 裂解液，将每组反应总体积补足至 500 μL。
例如，当蛋白浓度为 2 mg/mL 时：
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上述表格对应后续加入抗体前的体系。抗体加入后总体积会略有增加。
同一次比较中，IP:A 与 IP:IgG 应保持相同的总蛋白量、相近的裂解液体积与相同的处理条件。
留取 Input 样本
从充分混匀的免疫沉淀起始样本中，取出 25 μL 蛋白裂解液，作为 Input 样本。
提示
该体积对应 500 μL 起始体系的 5%。
实际留样后，剩余样本中的蛋白质量会相应减少；
如果需要严格保持 500 μg 用于 IP，应在留取 Input 前另行配足样本。
向 25 μL Input 加入约 8.3 μL 4× SDS 上样缓冲液，混合得到约 33.3 μL 的 1× 上样样本。
将 Input 放置于冰上，待后续与 IP 样本一起处理，也可以按照上样缓冲液说明书完成加热变性后进行短期保存。
Input 样本通常只需要占 IP 起始蛋白量的 2%–5%。对于表达特别丰富的蛋白，可适当减少 Input 上样比例，避免 WB 条带过曝。
准备 Protein A/G 磁珠
从 4°C 冰箱中取出 Protein A/G 磁珠。
轻轻颠倒磁珠储存管，使底部磁珠均匀悬浮。
按照每个预清除反应 20 μL 原始磁珠悬液的初始用量，吸取磁珠至新的离心管。
将离心管放在磁力架上，等待约 1 min，或者等待液体变澄清。
吸去上清，保留吸附在管壁上的磁珠。
向离心管加入 500 μL 预冷 Co-IP 裂解液。
取下离心管，轻轻颠倒混匀，再放回磁力架上。
待磁珠重新聚集后，吸去上清。
重复清洗一次。
这里的 20 μL 指吸取的商品磁珠悬液体积，具体磁珠固相体积取决于产品浓度。不同厂商的磁珠结合能力存在差异，应参考说明书调整使用量。
进行预清除
将步骤 3.3 留样后用于 IP 的蛋白裂解液加入预洗后的磁珠中。
置于 4°C 端对端旋转混匀仪上，温和旋转约 20–30 min。
预清除结束后，把离心管放回磁力架。
待磁珠被吸附后，小心转移上清至新的离心管。
丢弃用于预清除的磁珠。
预清除的目的是提前去除部分容易与磁珠表面非特异性结合的蛋白。我们希望这些蛋白在正式加入抗体之前，就已经被尽量排除。
但预清除也可能降低某些蛋白复合物的回收量。若目标蛋白含量很低，或蛋白 B 在预清除过程中损失明显，应比较预清除前后的 Input，并决定是否保留该步骤。
加入特异性抗体
向预清除后的蛋白裂解液中加入 IP 级抗蛋白 A 抗体。
本方案以每组加入 2 μg 抗体作为初始条件。
假设抗体储备液浓度为 1 mg/mL，则每组需加入 2 μL 抗体。
同时向 IgG 阴性对照中加入相同质量的匹配同型 IgG 抗体。
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提示
注意，抗体用量应以该抗体的免疫沉淀验证信息为准。
适用于 Western Blot 的抗体，未必适用于免疫沉淀；部分抗体只能识别变性蛋白，无法有效结合天然构象下的蛋白 A。
孵育抗体与蛋白复合物
将加入抗体的裂解液放置于 4°C 旋转混匀仪上。
设置温和的端对端旋转，使液体持续移动而不产生大量气泡。
常用孵育时间为 4 h 至过夜（约 12–16 h）。
如果目标蛋白容易降解，或者你怀疑 A 与 B 的结合比较短暂，可以先尝试 2–4 h 的较短孵育。
孵育时间延长后，抗体有更多机会接触目标蛋白，但某些非特异性蛋白也可能逐渐积累在免疫复合物中。
预洗用于正式 IP 的磁珠
另取 Protein A/G 磁珠，每组准备 25 μL 原始磁珠悬液作为起始用量。
按照步骤 4.1 的方法，使用 500 μL 预冷 Co-IP 裂解液清洗磁珠两次。
将磁珠重新悬浮于少量预冷裂解液中。
提示
Protein A 和 Protein G 对不同宿主、不同亚型抗体的亲和力不同。
使用混合 Protein A/G 磁珠通常比较方便，但仍需确认待用抗体能够被所选磁珠有效捕获。
捕获抗体-蛋白复合物
将预洗后的磁珠加入步骤 5.2 中已经完成抗体孵育的样本。
轻轻颠倒混匀。
将离心管重新放入 4°C 旋转混匀仪中，继续孵育 1–2 h。
在这一过程中，磁珠通过 Protein A/G 结合抗体的 Fc 区域，进一步捕获抗体结合的目标蛋白及其共沉淀蛋白。
磁珠孵育结束后，取下离心管并放入磁力架。
等待 1–2 min，直至上清明显澄清。
轻轻吸去上清。
提示
建议第一次实验将少量 IP 后上清另行保存，标记为 Flow-through（FT）。
后续可用 WB 检查其中是否仍有大量蛋白 A，以评估免疫沉淀的捕获效果。
第一次洗涤
从磁力架上取下离心管。
沿管壁加入 500 μL 预冷 Co-IP 洗涤缓冲液。
轻轻颠倒离心管，使磁珠重新均匀分散。
置于 4°C 旋转混匀仪上，温和混匀约 3–5 min。
随后将离心管放回磁力架。
等待磁珠完全聚集后，吸去上清。
这个过程中，原先悬浮的磁珠会逐渐移动到靠近磁铁的一侧。吸液时，把吸头放在磁珠聚集位置的对侧，缓慢移走上清。
重复洗涤
按照相同方法，再洗涤 3 次。
标准初始洗涤参数如下：
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洗涤次数可以根据背景和蛋白互作稳定性调整至 3–5 次。
这里有一个需要注意的现象：洗涤液越严格，背景蛋白通常越容易减少，但某些弱相互作用蛋白也可能随上清一起流失。
如果你发现每增加一次洗涤，蛋白 B 的信号就逐渐变弱，而蛋白 A 依然保持较高的沉淀量，需要考虑 A-B 复合物是否对当前洗涤条件敏感。
最后一次洗涤
完成最后一轮洗涤后，将离心管放回磁力架。
等待磁珠充分聚集。
小心吸去大部分洗涤液，再使用小量程移液器除去残余液体。
操作时避免让吸头碰触磁珠沉淀。
残留洗涤液会稀释下一步加入的 SDS 上样缓冲液，导致不同样本间最终洗脱体积不一致。
加入 SDS 上样缓冲液
从磁力架取下离心管。
向磁珠中加入 30 μL 预先配好的 1× SDS 上样缓冲液。
轻轻吹打数次，使磁珠充分重悬。
此时，样本中包含结合在磁珠上的免疫复合物，以及用于破坏蛋白天然结构的 SDS 等组分。
加热洗脱
将离心管置于恒温金属浴中。
按以下参数处理：
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95°C 加热通常能够使多数蛋白变性，并促使免疫沉淀蛋白从磁珠上释放。
但如果你的目标蛋白容易聚集，或者蛋白具有特殊的热敏感性质，需要根据抗体及蛋白性质调整温度。部分蛋白可以使用 70°C、10 min 的条件进行比较。
提示
另外，部分磁珠产品明确限制加热条件，因此应以厂家说明书为准。
分离磁珠与蛋白洗脱液
加热结束后，将样本短暂冷却。
把离心管放回磁力架，使磁珠聚集。
将含有蛋白的上清转移至新的离心管。
这一管就是最终用于 Western Blot 检测的 IP 洗脱样本。
请特别注意：
使用常规 SDS 加热洗脱时，原先结合在磁珠上的 IP 抗体也可能部分进入洗脱液。因此，在后续 WB 中可能出现约 50 kDa 的 IgG 重链和约 25 kDa 的 IgG 轻链。
这两类条带如果恰好与蛋白 A 或 B 的分子量接近，会给结果判读带来麻烦。
对于这种情况，建议考虑抗体交联磁珠、使用特殊二抗或改用标签结合体系，以降低抗体链干扰。
准备检测样本
取出之前保存的 Input 样本。
如果 Input 尚未经过加热变性，则按照与 IP 样本兼容的条件处理。
将 Input、IP:A 和 IP:IgG 样本按照预先设计的顺序排列。
对于首次实验，建议分别检测蛋白 A 和蛋白 B。蛋白 A 用于确认是否被成功富集，蛋白 B 则用于判断是否发生共沉淀。
SDS-PAGE 电泳
根据目标蛋白的分子量选择合适浓度的聚丙烯酰胺凝胶。
常见蛋白检测可从 10% 或 4%–20% 梯度胶开始。
参考上样条件如下：
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Input 和 IP 的蛋白含量本身就有较大差异。Input 代表未经富集的样本，IP 则代表经过免疫沉淀浓缩后的样本。
因此，两者的条带强度通常不能直接按相同上样体积比较。定量分析时，应结合 Input 比例、IP 洗脱总体积和不同样本的实际加载比例进行校正。
转膜
电泳结束后，按照所用 Western Blot 转膜系统的操作说明，将凝胶中的蛋白转移至 PVDF 或 NC 膜上。
例如，对于常规湿转体系，可将 100 V、约 60 min 作为部分中等分子量蛋白的初始测试条件。实际转膜时间与电流取决于蛋白分子量、膜类型、转膜缓冲液及设备。
大分子量蛋白可能需要更长的转膜时间。小分子量蛋白则需要关注是否发生过度转膜。
抗体孵育
将转膜后的膜放入适合所用抗体的封闭液中。
室温轻轻摇动约 1 h。
随后加入相应的蛋白 A 或蛋白 B 检测抗体，按照抗体说明书推荐的浓度和温度孵育。
若采用常规过夜一抗孵育，可在 4°C 轻轻摇动约 12–16 h。
孵育结束后，使用 TBST 清洗膜，常用条件为每次 5–10 min，共 3 次。
加入相匹配的二抗，于室温孵育约 1 h，再清洗膜 3 次。
提示
注意选择能够尽量避免识别变性 IP 抗体重链或轻链的检测体系，尤其是目标蛋白分子量位于 25 kDa 或 50 kDa 附近时。
显影与图像保存
按照化学发光底物说明书，将 ECL 工作液均匀覆盖在膜表面。
使用化学发光成像系统采集图像。
建议同时保存短曝光和长曝光图像。
短曝光图像可以减少强条带过曝，长曝光图像则有助于观察较弱的共沉淀信号。
用于灰度定量的条带，应选择处于检测系统线性范围内的图像。若条带已经饱和，灰度值就无法准确反映蛋白量。
先检测蛋白 A。
正常情况下，Input 中应能检测到蛋白 A，IP:A 组也应检测到蛋白 A。IP:IgG 组则应表现为无信号或较低背景信号。
如果 IP:A 组完全检测不到 A，建议先检查抗体是否经过 IP 验证，以及细胞裂解液中是否含有足量的可溶性蛋白 A。
只有确认诱饵蛋白成功富集后，才能进一步解释蛋白 B 的共沉淀结果。
随后使用抗蛋白 B 抗体检测同一批样本。
下面展示一个理想化的 Western Blot 结果。
理想化 Co-IP 免疫印迹示意图。上方检测诱饵蛋白 A，下方检测候选蛋白 B。
观察蛋白 B 的条带。如果它出现在 Input 和 IP:A 组中，而 IgG 对照没有相应条带，说明 B 随着 A 一起被富集。
如果 IgG 对照也出现与 IP:A 组接近的蛋白 B 信号，就需要排查 B 是否容易与磁珠、IgG 或其他组分发生非特异性结合。
对于内源性 Co-IP，条带可能较弱。由于蛋白相互作用本身可能只发生在部分细胞、部分蛋白或特定刺激条件下，IP:B 的信号强度也可能显著低于 Input 中的强表达蛋白。
如果要比较不同处理组之间蛋白相互作用的变化，建议使用 ImageJ 或 Fiji 对处于线性检测范围内的免疫印迹条带进行灰度分析。
对于每个样本，先扣除局部背景，再分别测量 IP 样本中的蛋白 A 与蛋白 B 信号。
一种常用的初步指标是：
RIP = IB,IP / IA,IP
该比值有助于评估单位诱饵蛋白所关联的候选蛋白信号。
但如果实验处理显著改变了 A 或 B 在细胞中的表达水平，仅比较 IP 中的 B/A 比值可能会产生误判。
此时应同时检查 Input 中的 A 和 B，确认两种蛋白的表达是否发生变化，并在必要时进行 Input 校正。
还要注意，抗体表位暴露程度、免疫沉淀效率和检测信号的非线性变化，都会影响最终灰度比值。因此，这些结果一般应作为相对共沉淀指标。
先检查 Input。
如果 Input 中也检测不到 A，说明需要回到细胞表达或蛋白提取环节。
如果 Input 有清晰的 A 条带，而 IP 中完全没有，就要重点检查 IP 抗体和磁珠捕获效率。
可以保留 IP 后上清，比较 A 在 IP 前后的含量。如果大部分 A 仍留在上清中，说明捕获步骤可能效率不足。
建议优先使用经过免疫沉淀验证的抗体，并确认抗体宿主及亚型与磁珠匹配。
这种情况需要考虑多种可能。
蛋白 B 可能在当前细胞状态下与 A 结合较少，也可能因为裂解液盐浓度、去污剂浓度或洗涤条件导致复合物解离。
可以先检查 Input 中 B 的表达情况，再测试更温和的裂解及洗涤条件，例如将 Triton X-100 从 0.5% 降至 0.1%–0.3%，并比较不同条件的效果。
如果研究对象是短暂、刺激依赖性或膜相关相互作用，还需要确认细胞处理时间和蛋白提取方式是否适合目标复合物。
当 IgG 组和 IP:A 组都出现 B 条带时，建议检查磁珠是否存在较强的非特异性吸附。
可以适当增加预清除步骤，或者测试更严格的洗涤条件。
对于盐浓度优化，建议从 150 mM NaCl 起步，比较 200 mM 和 300 mM 条件下的背景与目的蛋白回收量。
洗涤条件变严格后，应同步检测 IP:A 中的 A 与 B。这样才能判断背景下降的同时，特异性复合物是否也出现了损失。
如果目的蛋白刚好位于 25 kDa 或 50 kDa 附近，需要警惕免疫沉淀抗体轻链和重链产生的干扰。
常规还原性 SDS 上样条件可使 IgG 分离成约 25 kDa 轻链和约 50 kDa 重链。
对于这一问题，可以选择识别天然构象 IgG 的专用二抗、轻链特异性检测体系，或者将 IP 抗体共价交联在磁珠上。
记录每次收样的细胞融合度、细胞数量、BCA 测定结果、抗体批次及磁珠用量。
同时固定裂解时间、免疫沉淀时间和洗涤条件。
例如，一次实验采用 150 mM NaCl、4 次洗涤，另一次实验改为 300 mM NaCl、6 次洗涤，即使使用同一种细胞和抗体，两次测得的蛋白 B 信号也可能出现较大差异。
因此，正式比较不同生物学条件时，应尽量使用经过预实验确认的一致流程。
注意
维持低温条件。
从细胞裂解到磁珠洗涤，尽量保持样本处于 4°C 或冰上。
低温能够减缓蛋白降解，同时有助于维持部分蛋白复合物的稳定性。
注意
使用适合 Co-IP 的裂解体系。
目标蛋白的定位和相互作用性质会影响裂解液选择。
核蛋白、膜蛋白以及依赖金属离子的蛋白复合物，应分别验证提取效率与互作保留情况。
注意
避免磁珠损失。
每次使用磁力架时，等待磁珠充分聚集后再吸取上清。
吸头不要直接刮擦磁珠团块，尤其是最后一次去除洗涤液时。